뮤린 폐 판막의 상관 화상 진찰을 위한 수술 및 견본 처리
Summary
여기서, 우리는 뮤린 폐 판막의 절제, 가압, 고정 및 이미징에 대한 상관 관계 워크플로우를 설명하여 총 형태 및 국소 세포외 매트릭스 구조를 결정합니다.
Abstract
심장 판막 관련 질병 (HVD)의 근본 원인은 애매합니다. Murine 동물 모델은 HVD를 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공하지만, 여러 길이의 저울에 걸쳐 구조와 조직을 정확하게 정량화하는 데 필요한 수술 및 기악 전문 지식은 발전을 저해했습니다. 이 작품은 다른 길이 비늘에서 심장 판막을 묘사하기위한 뮤린 해부, en 블록 염색, 샘플 처리 및 상관 관계 이미징 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 수압기압은 심장판막 형성을 화학적으로 고정하여 측두체 이질성을 제어하는 데 사용되었습니다. 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영(μCT)은 심장 판막의 형상을 확인하고 직렬 블록 페이스 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)에 필요한 다운스트림 샘플 처리에 대한 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 세포외 매트릭스(ECM)의 고해상도 직렬 SEM 이미지를 촬영하고 재구성하여 조직의 로컬 3D 표현을 제공합니다. μCT 및 SBF-SEM 이미징 방법은 폐 밸브를 가로지르는 공간 적 변화를 극복하기 위해 상관관계가 있었다. 제시된 작품은 폐 판막에만 있지만, 이 방법론은 생물학적 시스템의 계층 적 조직을 설명하기 위해 채택될 수 있으며 여러 길이 의 구조 특성에 중추적인 역할을 합니다.
Introduction
폐 판막(PV)은 오른쪽 심실과 폐 동맥 사이의 단방향 혈류를 보장하는 역할을 합니다. 폐 막막 기형은 선천성 심장 질환의 여러 형태와 연관된다. 선천성 심장 판막 질환 (HVD)에 대한 현재 치료는 환자의 일생 동안 다중 침습적 수술을 필요로 할 수있는 valvular 수리 또는 밸브 교체입니다1. 심장 판막의 기능은 구조에서 유래되는 것으로 널리 받아들여졌으며, 종종 구조 기능 상관 관계라고도 합니다. 보다 구체적으로, 심장의 기하학적 및 생체 역학적 특성은 그 기능을 지시합니다. 기계적 특성은 차례로 ECM의 조성 및 구성에 의해 결정됩니다. 뮤린 심장 판막의 생체역학적 특성을 결정하는 방법을 개발함으로써, 형질전환 동물 모델은 심장 판막 기능 및 기능 장애2,3,4,5에ECM의 역할을 심문하는 데 사용될 수 있다.
murine 동물 모형은 다른 종에 비교된 마우스에서 더 쉽게 유효하기 때문에 인간적인 모형이 분자 연구 결과를 위한 표준으로 오랫동안 여겨져 왔습니다. 뮤린 트랜스제닉 모델은 심장 판막 관련 질병을 연구하기위한 다양한 플랫폼을 제공합니다6. 그러나, 기하학과 ECM 조직을 모두 특성화하기 위한 외과 전문 지식과 계측 요구 사항은 HVD 연구를 진행하는 데 큰 장애물이 되었습니다. 문학의 Hstological 데이터는 뮤린 심장 판막 세포 외 매트릭스 함량에 그림을 제공하지만, 단지 2D 이미지의 형태로, 3D아키텍처7을설명 할 수 없습니다7,8. 또한 심장 판막은 공간적으로나 현세적으로 이질적이기 때문에 샘플링 및 형태가 고정되지 않으면 ECM 조직에 관한 실험 전반에 걸쳐 결론을 도출하기가 어렵습니다. MRI 또는 3D 에코카르디그래피와 같은 기존의 3D 특성화 방법은 ECM 구성 요소9,10을해결하는 데 필요한해상도를제공하지 않는다.
이 작품은 심장 사이클로 인한 측두체 이질성이 수력성 기압으로 뮤린 PV의 변형을 고정하여 해결된 완전히 상관관계적인 워크플로우를 자세히 설명합니다. 공간 이질성은 다양한 길이 의 척도에 걸쳐 다양한 이미징 양식, 특히 μCT 및 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사에서 관심 영역을 샘플링하고 데이터 세트를 등록하여 정확하게 제어되었습니다. 다운스트림 샘플링을 안내하기 위한 μCT로 정찰하는 이 방법은 이전에 제안되었지만, 폐 판막이 시간적 변화를 나타내기 때문에 수술수준(11)에추가적인 수준의 제어가 필요하였다.
뮤린 심장 판막 생체 역학을 설명하는 생체 공학 연구에서는 희소하며 변형 동작을 설명 할 때 계산 모델에 의존합니다. 나노미터 길이 스케일의 로컬 세포 외 데이터가 심장 판막의 형상 및 위치와 관련이 있는 것이 매우 중요합니다. 이는, 차례로, 기존의 생체 역학 심장 판막모델(12,13,14)을강화하는 데 사용될 수 있는 기계적으로 기여하는 ECM 단백질의 정량화가능하고공간적으로 매핑된 분포를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심실제거는 두 가지 목적을 제공합니다. 첫째, 심실측을 대기압에 노출시켜 폐밸브의 동맥측으로부터 경진압력을 가해 폐트렁크의 비틀림을 방지하기 위한 안정적인 베이스를 제공한다. 가압 하는 동안, 폐 트렁크는 복사 하 고 열등 하 게 분산, 뒤틀린 경향이 만들기, 폐 트렁크의 붕괴를 일으키는. 식염수 용액으로 폐 밸브를 미리 로드하면 가압이 적절하고 시스템에 누출이 있는지 확인하기 위…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 부분적으로 R01HL139796 및 R01HL128847 교부금으로 지원되며 CKB 및 RO1DE028297 및 DWM용 CBET1608058에 지원됩니다.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
