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화학

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

Published: May 23, 2021
doi:
10.3791/62577
,
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center,Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

Abstract

이 프로토콜은 bactericidal 효소의 면역 단백질을 식별합니다: 복리신 E3 및 박테리아는 항생제 유도를 사용하여 병원성 대장균 균주에 의해 생성되고, MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광및 하향식 프로테오믹 분석에 의해 확인된 것으로, 사내에서 개발된 소프트웨어와 함께. 배리신 E3(Im3)의 면역 단백질과 박테리오신(Im-Bac)의 면역 단백질은 산성, 글루타믹산 및 아스파라진 잔류물의 C-말단 측에서 폴리펩타이드 백본 분열(PBC)에 의해 생성된 눈에 띄는 b-및/또는 y형 단편 이온으로부터 확인되었다. 이 소프트웨어는 세균균의 전체 게놈 염기서열분석에서 파생된 실리코 단백질 서열에서 빠르게 스캔합니다. 또한 이 소프트웨어는 성숙한 단백질 서열이 잘린 경우 단백질 서열의 아미노산 잔류물을 반복적으로 제거합니다. 단일 단백질 서열은 각 면역 단백질에 대해 검출된 것과 일치하는 질량 및 단편 이온을 소유했습니다. 그런 다음 후보 순서를 수동으로 검사하여 감지된 모든 조각 이온을 할당할 수 있는지 확인했습니다. Im3의 N 단말 메티오닌은 번역 후 제거된 반면 임박은 완전한 시퀀스를 가졌다. 또한, 우리는 PBC에 의해 형성된 2개 또는 3개의 비보완 단편 이온만이 올바른 단백질 서열을 식별하는 데 필요하다는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 프로모터(SOS box)는 세균균균의 플라스미드 게놈에서 항균 및 면역 유전자의 상류로 확인되었다.

Introduction

질량 분석법에 의한 소화되지 않은 단백질의 분석 및 식별을 하향식 프로테오믹 분석1,2,3,4라고합니다. 현재 는 전기분무 이온화(ESI)5 및 고해상도 질량 분석기6,정교한 해리 기술, 예를 들어 전자 전달 해리(ETD), 전자 포획 해리(ECD)7,자외선 광 해리(UV-PD)8등을 활용하는 확립된 기술이다.

다른 소프트 이온화 기술은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)9,10,11은 하향식 분석에 덜 광범위하게 활용되고 있으며, 이는 주로 다른 질량 분석기와 비교하여 해상도가 제한된 비행 시간(TOF) 질량 분석기와 결합되기 때문이다. 이러한 한계에도 불구하고 MALDI-TOF 및 MALDI-TOF-TOF 계측기는 순수 단백질과 분획되고 분수되지 않은 단백질 혼합물의 신속한 하향식 분석을 위해 악용되었습니다. 순수 단백질의 식별을 위해, 산내 붕괴(ISD)는 ISD 단편 이온의 질량 분석(MS) 분석뿐만 아니라 단백질 이온 단편의 질량 분석법(MS/MS)을 허용하고, 표적 단백질의 N-및 C-테르미니로부터 서열특이적 단편을 자주 제공하는, 에드먼12, 에드만12와유사하게 매우 유용한 기술이다. . ISD 접근법의 단점은 Edman 시퀀싱에서와 같이 샘플에 단 하나의 단백질만 포함되어야 한다는 것입니다. 1개의 단백질 요구 사항은 전구체 이온에 단편 이온의 명백한 기여에 대한 필요성 때문입니다. 2개 이상의 단백질이 샘플에 존재하는 경우, 어떤 단편 이온이 전구체 이온에 속하는지 할당하기가 어려울 수 있다.

단편 이온/전구체 이온 어트리뷰션은 MALDI-TOF-TOF-MS/MS를 사용하여 해결할 수 있습니다. 모든 고전적인 MS/MS 실험과 마찬가지로 전구체 이온은 단편화 전에 대량 선택/격리되며, 검출된 단편 이온은 특정 전구체 이온에 기인할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법에 사용할 수 있는 해리 기술은 주로 높은 에너지 충돌 유도 해리(HE-CID)14 또는 포스트 소스 붕괴(PSD)15,16으로제한된다. HE-CID 및 PSD는 펩티드와 작은 단백질을 단편화하는 데 가장 효과적이며, 서열 커버리지는 경우에 따라 제한될 수 있다. 또한, PSD는 아파르산효과(17,18,19,20)라고불리는 현상에 의한 아파르트 및 글루타믹산 잔류물의 C-말단 측에서 주로 폴리펩티드 백본 골짜기(PBC)를초래한다.

MALDI-TOF-MS는 또한 미생물의 분류학적 식별에서 틈새 응용 프로그램을 발견했습니다: 박테리아21,곰팡이22,및 바이러스23. 예를 들어, MS 스펙트럼은 비교를 위해 패턴 인식 알고리즘을 사용하여 알려진 박테리아의 MS 스펙트럼의 참조 라이브러리와 비교하여 알려지지 않은 박테리아를 식별하는 데 사용됩니다. 이 접근 방식은 격리의 하룻밤 배양을 필요로하지만, 속도와 단순성 때문에 매우 성공적인 입증했다. 이러한 접근법(보통 20kDa 미만)에 의해 검출된 단백질 이온은 속 및 종 수준에서 분류학 적 분해를 허용하는 MS 지문을 포함하며, 어떤 경우에는 하위종(24) 및 균주수준(25,26)에서분류학을 용이한다. 그러나, 분류잠재적으로 병원성 미생물을 분류할 뿐만 아니라 특정 독성 요인, 독소 및 항균 저항(AMR) 요인을 식별할 필요가 있습니다. 이를 달성하기 위해 펩티드, 단백질 또는 소분자의 질량은 MS에 의해 측정되고 이후에 MS/MS에 의해 분리되고 단편화됩니다.

병원성 박테리아는 종종 플라스미드에게 불린 DNA의 원형 조각을 전송합니다. 플라스미드는, prophages와 더불어, 박테리아 사이 수평 유전자 전송의 중요한 벡터이고 박테리아를 통해 항균 저항 및 그밖 독성 요인의 급속한 퍼짐에 책임 있습니다. 플라스미드는 또한 항균 (AB) 유전자, 예를 들어, 복리신 및 박테리신을 수행 할 수 있습니다. 이러한 유전자가 발현되고 단백질이 분비될 때, 동일한 환경 틈새 시장을 차지하는 이웃 박테리아의 단백질 번역 기계를 비활성화하는 역할을한다(27). 그러나, 이러한 bactericidal 효소는 또한 그들을 생산 하는 호스트에 위험을 제기할 수 있습니다. 결과적으로, 유전자는 AB 효소의 기능을 구체적으로 억제하고 면역 단백질(Im)으로 지칭되는 숙주에 의해 공동 발현된다.

미토마이신-C 및 시프로플록사신과 같은 DNA 손상 항생제는 종종 시가 독소 생성 대장균(STEC)에서 SOS 반응을 유도하는 데 사용되며, 시가 독소 유전자(stx)는 세균게놈(28)에 존재하는 프로파지 게놈 내에서 발견된다. 우리는 이전에 항생제 유도, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 STEC 균주29,30,31,32에의해 생성된 Stx 유형 및 아류형을 검출하고 식별했습니다. 전작에서는 STEC O113:H21 균주 RM7788이 미토마이신-C로 보충된 한천 매체에서 하룻밤 사이에 배양되었다. 그러나, m/z~7816에서 Stx2a의 예상 B-서브유닛을 검출하는 대신, m/z~7839에서 상이한 단백질 이온이 검출되고 알 수 없는 기능(33)의플라스미드 인코딩 된 가상 단백질로 확인되었다. 현재 작업에서, 우리는 항생제 유도를 사용하여이 균주에 의해 생성 된 두 개의 플라스미드 인코딩 AB-임 단백질을 확인, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, 및 전체 게놈 시퀀싱에서 파생 된 실리코 단백질 서열에서 처리 및 스캔개발 독립 형 소프트웨어를 사용하여 하향식 proteomic 분석 (WGS). 또한 시퀀스 잘림과 관련된 번역 후 수정(PTM)의 가능성이 소프트웨어에 통합되었습니다. 면역 단백질은 인산 효과에 의해 유발되고 MS/MS-PSD에 의해 검출된 PBC로부터의 성숙한 단백질 이온 및 서열 특이적 단편 이온의 측정질량으로부터 이 소프트웨어를 사용하여 확인되었다. 마지막으로, 프로모터는 이 긴장이 DNA 손상 항생제에 드러나면 이러한 유전자의 발현을 설명할 수 있는 플라스미드 게놈에서 AB/Im 유전자의 상류로 확인되었다. 이 작품의 일부는 2020년 가을 미국 화학 협회 가을 가상 회의 및 엑스포 (2020년 8월 17-20일)34에서발표되었습니다.

Protocol

1. 미생물 샘플 준비 루리아 국물(LB)의 접종 25mL은 멸균 1 μL 루프를 이용하여 글리세롤 스톡으로부터 대장균 O113:H21 균주 RM7788(또는 다른 세균균균)을 가진 50mL 원추형 튜브에서 접종하였다. 튜브 및 사전 배양을 37°C에서 4시간 동안 흔들림(200rpm)으로 캡합니다. 사전 배양된 국물의 알리쿼트 100 μL을 LB 한천 판에 퍼지고 미토마이신-C의 400 또는 800 ng/mL로 보충됩니다. 배양 식도?…

Representative Results

도 3(상단 패널)는 400 ng/mL 미토마이신-C로 보충된 LBA에서 하룻밤 사이에 배양된 STEC O113:H21 균주 RM7788의 MS를 나타낸다. m/z 7276, 7337 및 7841의 피크는 이전에 감기 충격 단백질 C(CspC), 냉쇼크 단백질 E(CspE), 및 알 수 없는 기능의 플라스미드 매개단백질로확인되었다. m/z 9780 [M+H]+에서의 단백질 이온은 도 3(하단 패널)에 도시된 바와 …

Discussion

프로토콜 고려 사항
현재 프로토콜의 주요 강점은 속도, 샘플 준비의 단순성 및 비교적 작동, 훈련 및 유지 보수가 쉬운 계측기의 사용입니다. 액체 크로마토그래피-ESI-HR-MS에 의한 상향식 및 하향식 프로테오믹 분석은 MALDI-TOF-TOF의 하향식에 대한 여러 면에서 유비쿼터스이며 훨씬 우수하지만 더 많은 시간, 노동 및 전문 지식이 필요합니다. 악기 복잡성은 종종 특정 악기 플랫폼이 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

단백질 바이오마커 시커 소프트웨어는 clifton.fagerquist@usda.gov 클리프턴 K. Fagerquist에 연락하여 자유롭게 사용할 수 있습니다(무료). 우리는 ARS에 의해이 연구의 지원을 인정 하고자, USDA, CRIS 교부금: 2030-42000-051-00-D.

Materials

4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4
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References

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

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Escherichia ColiAntibacterial Immunity ProteinsMALDI-TOF-TOF-MS/MSTop-down ProteomicsMass SpectrometryBacterial Protein IdentificationAntibiotic InductionSample PreparationHPLC-grade WaterSinapinic AcidMS Linear Mode AcquisitionMS/MS Reflectron Mode AcquisitionPrecursor MassIsolation WidthCIDMetastable Suppressor

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Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).
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