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화학

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

Published: May 23, 2021
doi:
10.3791/62577
,
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center,Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。

Abstract

このプロトコルは、抗生物質誘導を使用して病原性 大腸菌 株によって産生されるコリシンE3およびバクテリオシンの殺菌酵素の免疫タンパク質を同定し、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法およびトップダウンプロテオミクス分析によって社内で開発されたソフトウェアで同定される。アシシンE3(Im3)の免疫タンパク質とバクテリオシン(Im-Bac)の免疫タンパク質は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン残基のC末端側のポリペプチド骨格切断(PBC)によって生成された顕著なb-および/またはy型断片イオンから同定された。このソフトウェアは、細菌株の全ゲノムシーケンシングに由来する インシリコ タンパク質配列を迅速にスキャンします。また、このソフトウェアは、成熟タンパク質配列が切り捨てられた場合にタンパク質配列のアミノ酸残基を繰りつ離します。1つのタンパク質配列は、各免疫タンパク質について検出されたものと一致する質量およびフラグメントイオンを有する。候補シーケンスを手動で検査し、検出されたすべてのフラグメントイオンが割り当てられることを確認しました。Im3のN末端メチオニンは翻訳後に除去されたのに対し、Im-Bacは完全な配列を持っていた。さらに、正しいタンパク質配列を同定するためにPBCによって形成された非相補性フラグメントイオンは2~3個しか必要でないことがわかりました。最後に、プロモーター(SOSボックス)を、細菌株のプラスミドゲノム中の抗菌遺伝子および免疫遺伝子の上流で同定した。

Introduction

質量分析法による未消化タンパク質の分析および同定は、トップダウンプロテオーム解析1、2、3、4と呼ばれる。エレクトロスプレーイオン化(ESI)5と高解像度質量分析計6を利用した技術として確立され、高度な解離技術、例えば電子転写解離(ETD)、電子捕捉解離(ECD)7、紫外線光解離(UV-PD)8、等を利用する技術が確立されている。

他のソフトイオン化技術は、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化(MALDI)9、10、11であり、主に飛行時間(TOF)質量分析装置と結合されているため、トップダウン分析にはあまり広く利用されておらず、他の質量分析装置と比較して分解能が限られている。これらの制限にもかかわらず、MALDI-TOFおよびMALDI-TOF-TOFの装置は、純粋なタンパク質の迅速なトップダウン分析と、タンパク質の分画および未分化混合物のために利用されてきました。純粋なタンパク質の同定のために、インソース崩壊(ISD)は、ISD断片イオンの質量分析(MS)分析、ならびに標的のN-およびC末筋からしばしば配列特異的断片を提供するタンパク質イオン断片のタンデム質量分析(MS/MS)を可能にするため、特に有用な技術である。.ISD アプローチの欠点は、エドマンシーケンシングと同様に、サンプルに含まれているタンパク質が 1 つだけである点です。1つのタンパク質要件は、前駆体イオンへのフラグメントイオンの明確なアトリビューションの必要性によるものです。サンプルに複数のタンパク質が存在する場合、どのフラグメントイオンがどの前駆物質に属しているかは、割り当てが難しい場合があります。

フラグメントイオン/前駆体イオンアトリビューションは、MALDI-TOF-TOF-MS/MSを使用して対処することができます。従来のMS/MS実験と同様に、前駆体イオンは断片化の前に質量選択/単離され、検出されたフラグメントイオンは特定の前駆体イオンに起因する可能性があります。しかしながら、このアプローチで利用可能な解離技術は、主に高エネルギー衝突誘発解離(HE-CID)14またはポストソース崩壊(PSD)15,16に限定される。HE-CIDおよびPSDは、ペプチドおよび小タンパク質の断片化に最も効果的であり、配列被覆範囲は、場合によっては制限される可能性がある。また、PSDは、アスパラギン酸効果17、18、19、20と呼ばれる現象によって、主にアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基のC末端側にポリペプチド骨格切断(PBC)をもたらす。

MALDI-TOF-MSはまた、微生物の分類学的同定におけるニッチな用途を発見しました: 細菌21、 真菌22、およびウイルス23.例えば、MSスペクトルは、比較のためにパターン認識アルゴリズムを用いて既知の細菌のMSスペクトルの参照ライブラリーと比較して未知の細菌を同定するために使用される。このアプローチは、その速度とシンプルさのために非常に成功していますが、分離物の一晩の培養が必要です。このアプローチによって検出されたタンパクイオン(通常は20kDa以下)は、属および種レベルでの分類学的分解能を可能にするMS指紋を含み、場合によってはサブ種24および株レベル25、26で。しかし、病原性の可能性のある微生物を分類的に分類するだけでなく、特定の病原性因子、毒素、抗菌性(AMR)因子を同定する必要があります。これを達成するために、ペプチド、タンパク質、または小分子の質量をMSによって測定し、その後MS/MSによって単離され、断片化されます。

病原性細菌は、しばしばプラスミドと呼ばれるDNAの円形の断片を運ぶ。プラスミドは、プロファージと共に、細菌間の水平遺伝子導入の主要なベクターであり、細菌間で抗菌性および他の毒性因子の急速な広がりを引き起す。プラスミドはまた、抗菌(AB)遺伝子、例えば、コリシンおよびバクテリオシンを運ぶことができる。これらの遺伝子が発現し、タンパク質が分泌されると、それらは、同じ環境ニッチ27を占める隣接細菌のタンパク質翻訳機械を無効にする作用をする。しかし、これらの殺菌酵素は、それらを産生する宿主にリスクをもたらす可能性もある。その結果、遺伝子は、AB酵素の機能を特異的に阻害し、その免疫タンパク質(Im)と呼ばれる宿主によって共発現される。

マイトマイシンCやシプロフロキサシンなどのDNA損傷性抗生物質は、細菌ゲノム28に存在するプロファージゲノム内に滋賀毒素遺伝子(stx)が見つかる滋賀毒素産生大腸菌(STEC)においてSOS応答を誘導するためによく用いられる。我々は、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス分析を使用して、STEC株29、30、31、32によって産生されるStx型およびサブタイプを検出し、同定した。前の研究では、STEC O113:H21株RM7788は、マイトマイシンCを補充した寒天培地上で一晩培養した。しかし、m/z~7816で予想されるStx2aのBサブユニットを検出する代わりに、m/z〜7839で異なるタンパク質イオンが検出され、未知の機能33のプラスミドコード化された仮説タンパク質として同定された。今回の研究では、全ゲノムシーケンシング(WGS)由来のインシリコタンパク質配列を処理およびスキャンするために開発されたスタンドアロンソフトウェアを用いて、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス解析を用いて、この株によって産生される2つのプラスミドコード化AB-Imタンパク質を同定した。さらに、シーケンス切り捨てを伴う翻訳後改変(PTM)の可能性がソフトウェアに組み込まれました。免疫タンパク質は、アスパラギン酸効果によって引き起こされたPBCからの成熟タンパク質イオンおよび配列特異的フラグメントイオンの測定質量からこのソフトウェアを使用して同定され、MS/MS-PSDによって検出された。最後に、この株がDNA損傷性抗生物質にさらされたときにこれらの遺伝子の発現を説明することができるプラスミドゲノム中のAB/Im遺伝子の上流にプロモーターが同定された。この作品の一部は、2020年8月17-20日の仮想会議&博覧会(2020年8月17-20日)34で発表された。

Protocol

1. 微生物学的サンプル調製 無菌1 μLループを使用してグリセロールストックから50 mL円錐管に25 mLのルリアスープ(LB)を大 腸菌 O113:H21株RM7788(または別の細菌株)を接種します。チューブをキャップし、4時間振る(200rpm)で37°Cで前培養します。 アリコート100 μLの前培養ブロスを400または800 ng/mLのミトマイシンCを補ったLB寒天プレートに広げる。培養寒天プレートを37°Cのイン…

Representative Results

図3(上パネル)は、400 ng/mLミトマイシン-Cを補充したLBA上で一晩培養したSTEC O113:H21株RM7788のMSを示す。m/z 7276、7337、および7841のピークは、以前はコールドショックタンパク質C(CspC)、コールドショックプロテインE(CspE)、および未知の機能を有するプラスミド媒介タンパク質と同定されていた。m/z 9780[M+H]+におけるタンパク質イオンを<strong class="xfig…

Discussion

プロトコルに関する考慮事項
現在のプロトコルの主な強みは、その速度、サンプル調製のシンプルさ、および操作が比較的容易で、訓練され、維持される楽器の使用です。液体クロマトグラフィー-ESI-HR-MSによるボトムアップおよびトップダウンプロテオミクス分析は、MALDI-TOF-TOFによるトップダウンに対して多くの点で普及していますが、より多くの時間、労力、専門知識が?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

プロテインバイオマーカーシーカーソフトウェアは、clifton.fagerquist@usda.gov でクリフトンK.Fagerquistに連絡することで、無料で(無料で)自由に利用できます。我々は、ARS、USDA、CRIS助成金によるこの研究の支援を認めてほしい:2030-42000-051-00-D。

Materials

4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4
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References

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Escherichia ColiAntibacterial Immunity ProteinsMALDI-TOF-TOF-MS/MSTop-down ProteomicsMass SpectrometryBacterial Protein IdentificationAntibiotic InductionSample PreparationHPLC-grade WaterSinapinic AcidMS Linear Mode AcquisitionMS/MS Reflectron Mode AcquisitionPrecursor MassIsolation WidthCIDMetastable Suppressor

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Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).
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