Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

L’analisi e l’identificazione di proteine non digerite mediante spettrometria di massa è indicata come analisi proteomica top-down^1,2,3,4. È ormai una tecnica consolidata che utilizza analizzatori di massa elettrospray (ESI)⁵ e ad alta risoluzione⁶e sofisticate tecniche di dissociazione, ad esempio dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD), dissociazione a cattura elettronica (ECD)^7,fotossociazione ultravioletta (UV-PD)⁸, ecc.

L’altra tecnica di ionizzazione morbida è il desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI)^9,10,11 che è stato meno ampiamente utilizzato per l’analisi top-down, in parte perché è principalmente accoppiato agli analizzatori di massa a tempo di volo (TOF), che hanno una risoluzione limitata rispetto ad altri analizzatori di massa. Nonostante queste limitazioni, gli strumenti MALDI-TOF e MALDI-TOF-TOF sono stati sfruttati per la rapida analisi top-down di proteine pure e miscele frazionate e non frazionate di proteine. Per l’identificazione di proteine pure, il decadimento in-source (ISD) è una tecnica particolarmente utile perché consente l’analisi di spettrometria di massa (MS) di ioni frammento ISD, nonché la spettrometria di massa tandem (MS/MS) di frammenti ionici proteici fornendo frammenti specifici di sequenza spesso dai termini N- e C della proteina bersaglio, analogamente al sequenziamento Edman^12,13 . Uno svantaggio dell’approccio ISD è che, come nel sequenziamento di Edman, il campione deve contenere una sola proteina. L’unico requisito proteico è dovuto alla necessità di attribuire in modo inequivocabile gli ioni frammento a uno ione precursore. Se due o più proteine sono presenti in un campione, può essere difficile assegnare quali ioni frammento appartengono a quali ioni precursori.

L’attribuzione di ioni frammento/ione precursore può essere affrontata utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Come con qualsiasi esperimento classico di MS/MS, gli ioni precursori sono selezionati/isolati in massa prima della frammentazione e gli ioni frammento rilevati possono essere attribuiti a uno specifico ione precursore. Tuttavia, le tecniche di dissociazione disponibili per questo approccio sono limitate principalmente alla dissociazione indotta da collisioni ad alta energia (HE-CID)¹⁴ o al decadimento post-sorgente (PSD)^15,16. HE-CID e PSD sono più efficaci nel frammentare peptidi e piccole proteine e la copertura della sequenza può, in alcuni casi, essere limitata. Inoltre, la PSD provoca la scissione della spina dorsale polipeptidica (PBC) principalmente sul lato C-terminale dei residui di acido aspartico e glutammico da un fenomeno chiamato effetto acido aspartico^17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS ha anche trovato un’applicazione di nicchia nell’identificazione tassonomica dei microrganismi: batteri²¹, funghi²²e virus²³. Ad esempio, gli spettri MS vengono utilizzati per identificare batteri sconosciuti rispetto a una libreria di riferimento di spettri MS di batteri noti utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli per il confronto. Questo approccio si è rivelato di grande successo grazie alla sua velocità e semplicità, sebbene richieda una coltivazione notturna dell’isolato. Gli ioni proteici rilevati da questo approccio (di solito sotto i 20 kDa) comprendono un’impronta digitale MS che consente la risoluzione tassonomica a livello di genere e specie e in alcuni casi alla sottospecie²⁴ e al livello di ceppo^25,26. Tuttavia, rimane la necessità non solo di classificare tassonomicamente i microrganismi potenzialmente patogeni, ma anche di identificare specifici fattori di virulenza, tossine e fattori di resistenza antimicrobica (AMR). Per raggiungere questo obiettivo, la massa di peptidi, proteine o piccole molecole viene misurata dalla SM e successivamente isolata e frammentata dalla SM / MS.

I batteri patogeni spesso trasportano pezzi circolari di DNA chiamati plasmidi. I plasmidi, insieme ai profagi, sono un importante vettore di trasferimento genico orizzontale tra batteri e sono responsabili della rapida diffusione della resistenza antimicrobica e di altri fattori di virulenza tra i batteri. I plasmidi possono anche trasportare geni antibatterici (AB), ad esempio colicina e batteriocina. Quando questi geni sono espressi e le proteine secrete, agiscono per disabilitare il meccanismo di traduzione proteica dei batteri vicini che occupano la stessa nicchia ambientale²⁷. Tuttavia, questi enzimi battericidi possono anche rappresentare un rischio per l’ospite che li ha prodotti. Di conseguenza, un gene è co-espresso dall’ospite che inibisce specificamente la funzione di un enzima AB e viene indicato come la sua proteina immunitaria (Im).

Gli antibiotici dannosi per il DNA come la mitomicina-C e la ciprofloxacina sono spesso usati per indurre la risposta SOS nell’E. coli produttore della tossina Shiga (STEC) il cui gene della tossina Shiga(stx) si trova all’interno di un genoma di profago presente nel genoma batterico²⁸. Abbiamo utilizzato l’induzione antibiotica, MALDI-TOF-TOF-MS/MS e l’analisi proteomica top-down in precedenza per rilevare e identificare tipi e sottotipi di Stx prodotti dai ceppi STEC^29,30,31,32. Nel lavoro precedente, il ceppo STEC O113:H21 RM7788 è stato coltivato durante la notte su mezzi di agar integrati con mitomicina-C. Tuttavia, invece di rilevare la subunità B prevista di Stx2a a m / z ~7816, è stato rilevato uno ione proteico diverso a m / z ~ 7839 e identificato come una proteina ipotetica codificata con plasmidi di funzione sconosciuta³³. Nel lavoro attuale, abbiamo identificato due proteine AB-Im codificate con plasmidi prodotte da questo ceppo utilizzando l’induzione antibiotica, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS e l’analisi proteomica top-down utilizzando un software autonomo sviluppato per elaborare e scansionare sequenze proteiche in silico derivate dal sequenziamento dell’intero genoma (WGS). Inoltre, nel software è stata incorporata la possibilità di modifiche post-traduzione (PTM) che comportano il troncamento della sequenza. Le proteine immunitarie sono state identificate utilizzando questo software dalla massa misurata dello ione proteina matura e dagli ioni frammento specifici della sequenza da PBC causati dall’effetto dell’acido aspartico e rilevati da MS / MS-PSD. Infine, è stato identificato un promotore a monte dei geni AB / Im in un genoma plasmidico che può spiegare l’espressione di questi geni quando questo ceppo è esposto a un antibiotico dannoso per il DNA. Parti di questo lavoro sono state presentate al National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 agosto 2020)³⁴.