使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS和自上而下的蛋白质组学分析鉴定 大肠杆菌 中的抗菌免疫蛋白

通过质谱法分析和鉴定未消化的蛋白质被称为自上而下的蛋白质组学分析1，2，3，4。它现在是一种成熟的技术，利用电喷雾电离（ESI）5和高分辨率质量分析仪^6，以及复杂的解离技术，例如电子转移解离（ETD），电子捕获解离（ECD）7，紫外线光解离（UV-PD）8等。

另一种软电离技术是基质辅助激光解吸/电离（MALDI）9，10，11，该技术在自上而下分析中的应用较少，部分原因是它主要耦合到飞行时间（TOF）质量分析仪，与其他质量分析仪相比，其分辨率有限。尽管存在这些局限性，但MALDI-TOF和MALDI-TOF-TOF仪器已被用于纯蛋白质以及蛋白质的分馏和普通混合物的快速自上而下分析。对于纯蛋白质的鉴定，源内衰变（ISD）是一种特别有用的技术，因为它允许对ISD片段离子进行质谱（MS）分析，以及蛋白质离子片段的串联质谱（MS / MS），提供通常来自靶蛋白的N-和C-末端的序列特异性片段，类似于Edman测序^12，13 .ISD方法的缺点是，与Edman测序一样，样品必须只包含一种蛋白质。一种蛋白质要求是由于需要明确地将片段离子归因于前体离子。如果样品中存在两种或多种蛋白质，则可能很难分配哪些片段离子属于哪些前体离子。

片段离子/前体离子归属可以使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS来解决。与任何经典的MS / MS实验一样，前体离子在碎片化之前被质量选择/分离，检测到的碎片离子可以归因于特定的前体离子。然而，可用于这种方法的解离技术主要限于高能碰撞诱导的解离（HE-CID）14或后源衰变（PSD）15，16。HE-CID和PSD在片段化肽和小蛋白质方面最有效，并且在某些情况下，序列覆盖率可能受到限制。此外，PSD导致多肽骨架裂解（PBC）主要在天冬氨酸和谷氨酸残基的C端侧通过称为天冬氨酸效应的现象17，18，19，20。

MALDI-TOF-MS在微生物分类鉴定中也发现了一个利基应用：细菌^21，真菌²²和病毒^23。例如，MS光谱用于通过使用模式识别算法进行比较的已知细菌的MS光谱参考库来识别未知细菌。这种方法因其速度和简单性而证明非常成功，尽管需要过夜培养分离物。通过这种方法检测到的蛋白质离子（通常低于20 kDa）包括MS指纹，允许在属和物种水平上进行分类分辨率，在某些情况下在亚种²⁴和菌株水平^25，26上进行分类分辨率。然而，不仅需要从分类学上对潜在的致病微生物进行分类，还需要确定特定的毒力因子、毒素和抗菌素耐药性（AMR）因子。为了实现这一点，肽，蛋白质或小分子的质量通过MS测量，然后通过MS / MS分离和片段化。

致病细菌通常携带称为质粒的圆形DNA片段。质粒和前噬细胞是细菌之间水平基因转移的主要载体，负责抗菌素耐药性和其他毒力因子在细菌中的快速传播。质粒也可能携带抗菌（AB）基因，例如大肠杆菌素和细菌素。当这些基因被表达并且蛋白质分泌时，它们的作用是禁用占据相同环境生态位的相邻细菌的蛋白质翻译机制²⁷。然而，这些杀菌酶也会对产生它们的宿主构成风险。因此，宿主共表达一个基因，该基因特异性地抑制AB酶的功能，被称为其免疫蛋白（Im）。

破坏DNA的抗生素如丝裂霉素-C和环丙沙星通常用于诱导产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）的SOS反应，其志贺毒素基因（stx）存在于细菌基因组中存在的原噬菌体基因组中^28。我们以前使用抗生素诱导，MALDI-TOF-TOF-MS / MS和自上而下的蛋白质组学分析来检测和鉴定STEC菌株^{29，30，31，32}产生的Stx类型和亚型。在之前的工作中，STEC O113：H21菌株RM7788在补充丝裂霉素-C的琼脂培养基上培养过夜。然而，不是在m / z〜7816处检测到Stx2a的预期B亚基，而是在m /z〜7839处检测到不同的蛋白质离子，并将其鉴定为具有未知功能的质粒编码的假设蛋白质^33。在目前的工作中，我们鉴定了两种质粒编码的AB-Im蛋白，这些质粒编码的AB-Im蛋白使用抗生素诱导，MALDI-TOF-TOF-MS / MS和自上而下的蛋白质组学分析，使用开发的独立软件处理和扫描来自全基因组测序（WGS）的硅质蛋白序列。此外，该软件还包含了涉及序列截断的翻译后修改（PTM）的可能性。使用该软件从天冬氨酸效应引起的成熟蛋白离子和PBC序列特异性片段离子的测量质量中鉴定免疫蛋白，并通过MS / MS-PSD检测。最后，在质粒基因组中AB / Im基因的上游鉴定出一种启动子，当该菌株暴露于DNA损伤抗生素时，该启动子可以解释这些基因的表达。这项工作的部分内容在美国国家化学学会2020年秋季虚拟会议和博览会（2020年8月17日至20日）上发表³⁴。