ייצור עמודות נימי פשוטות עם ביצועים גבוהים במיוחד עם גישת FlashPack
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הליך אריזת העמודות הנימיות של FlashPack הממוטב. יישום פרוטוקול ממוטב להתקנת פצצת לחץ נפוצה של 100 ברים מאפשר אריזה וייצור מהירים פי 10 של עמודות נימיות ארוכות בעלות ביצועים גבוהים במיוחד.
Abstract
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים נימיים אולטרה-גבוהים (UHPLC) היא כיום שיטה לבחירה עבור שלב הפרדת הדגימה בפרוטומיקה מבוססת LC-MS. עם זאת, עמודות נימיות הרבה פחות חזקות בהשוואה לאסיפים הנגדיים של הזרימה הגבוהה יותר שלהן. בגלל זיהום קל וחסימה, לעתים קרובות הם זקוקים להחלפה. זה הופך אותם לחלק יקר במידה ניכרת מעלות הניתוח הכוללת של LC-MS. אריזה פנימית של עמודות נימי UHPLC חוסכת הרבה כסף ומאפשרת התאמה אישית. עם זאת, הליך האריזה הסטנדרטי בפצצת הלחץ של 100 עמודות פועל היטב רק עבור עמודות HPLC אך הוא איטי מדי עבור סורבנטים UHPLC. כאן אנו מספקים תיאור של פרוטוקול FlashPack ממוטב החל על אותה הגדרת פצצת לחץ של 100 ברים. השיטה מבוססת על אריזה מצפיפות ריכוז סורבטים גבוהה במיוחד והיא מפותחת לייצור פנימי של עמודות נימיות UHPLC באורך בלתי מוגבל בזמן סביר.
Introduction
פרוטאומיה מודרנית מבוססת על ספקטרומטר מסה משולב כרומטוגרפיה נוזלית עם כרומטוגרפיה ננו-זרימה בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (הפרדת קוטר פנימי (ID) של 50-150 מיקרומטר ( ID)) המספקת את מהירות הניתוח והרגישות הטובות ביותר1. בעוד עמודות נימי UHPLC מסחריות רבות זמינות, המחיר שלהם מהווה חלק מרכזי של עלות מתכלים, במיוחד כאשר פרויקטים מגוונים מרובים מנוהלים במעבדה וזיהום טורים ספציפי לפרויקט הוא בעיה תכופה. חוץ מזה, אריזת עמודות בתוך הבית מאפשרת שימוש בסורבטים ספציפיים לניסוי מותאם אישית (כגון, למשל, פוליקט-Asorbent 2) ומאפייני עמודה שאינם זמינים לקנייה כעמודה מוכנה מראש.
כדי להתמודד עם זה, מעבדות רבות אורזות עמודים נימים בתוך הבית. עם זאת, הליך האריזה הנפוץ עם פצצת לחץ של 100 בר (תא הזרקת לחץ) 3 אינומתאים לאריזת העמודים UHPLC עקב לחץ גב גבוה של סורבנטים UHPLC מתחת ל-2 מיקרומטר וכתוצאה מכך ירידה דרמטית בשיעור האריזה בהשוואה לסורבנטים גדולים יותר של HPLC. בעוד עמודות UHPLC קצרות עדיין יכול להיות ארוז לאט מאוד, ייצור של עמודות UHPLC ארוכות הוא בלתי אפשרי פיזית4.
אריזת טור נימי סטנדרטית נעשית בלחצים נמוכים יחסית עד 100 ברים, ועם ריכוז דל מאוד של סורבטים. לפיכך, שני כיוונים אפשריים של האצת התהליך זמינים. ניתן להגדיל את לחץ האריזה5. עם זאת, זה דורש ציוד מיוחד, ולמעשה, התקנה של שיטה חדשה במעבדה. דרך נוספת היא להגדיל את ריכוז slurryסורבט 6. אריזת ריכוז סורבט גבוהה מתוארת בשילוב עם לחץ אריזה גבוה במיוחד בפרסום הקודם7. עם זאת, בלחץ 100 בר, אשר משמש ברוב פצצות האריזה הקיימות, ריכוז sorbent גבוה יותר תוצאות או קצב האריזה האטה או הפסקת אריזה על הסף. ההשפעה הוכחה לאחרונה בשל קיבוץ סורבטים בכניסה לעמוד, וטריק פשוט של חוסר היציבות של כיפה סורבט על ידי פטיש הכניסה לעמוד עם מוט מגנט בתוך מטען סורבט הוצע4. השיטה המתקבלת, הנקראת FlashPack, משתמשת באותה הגדרת אריזת פצצת לחץ של 100 ברים. יחד עם זאת, שינויים קלים אך קריטיים בהליך האריזה מאפשרים אריזה מריכוז וריכוז סורבט גבוה מאוד וייצור של עמודות UHPLC ארוכות מאוד (50 עד 70 ס”מ, וארוכ יותר) בפחות משעה, בעוד עמודה קצרה יכולה להיות מיוצרת תוך דקות עם איכות ההפרדה השווה לעמודות מסחריות של אותםפרמטרים 4. גישת FlashPack כבר שימשה בהצלחה בפרויקטים מרובים פרוטאומיים להכנת שני שלב הפוך (RP)8,9,10,11,12,13,14 ואינטראקציה הידרופילית (HILIC)2 עמודות נימיות.
כאן אנו מתארים בפירוט, את השינויים הדרושים להתאמה של גישת FlashPack להליך אריזת פצצת הלחץ הסטנדרטי של 100 בר.
Protocol
Representative Results
Discussion
אריזת טור נימי בתוך הבית פופולרית מאוד במעבדות גדולות העובדות על פרויקטים עצמאיים מרובים. עם זאת, שיטת אריזה נפוצה מהשעיית סורבנט בריכוז נמוך יש מגבלות עיקריות במהירות והוא אינו מסוגל לייצר עמודות UHPLC ארוכות.
FlashPack הוא שינוי של הליך האריזה הסטנדרטי מה שהופך את האריזה מריכוז סורבנט גבוה מאוד לאפשרי. הבסיס התיאורטי של השיטה טמון בחוסר היציבות השוטף של כיפה בכניסה לעמוד למשך כל תקופת האריזה. זה האחרון מושגת מבחינה טכנית על ידי כניסה לעמוד להיות מכה ברציפות עם מוט מגנט. השיטה של חוסר היציבות של כיפה מפותחת בכוונה כדי לקבל את הגדרת האריזה דומה לחלוטין לתהליך האריזה המשותף, אבל הטריק של FlashPack טמון בפרטי הכנת רפש סורבט, מיקום נימי, ושימוש בר מגנט במהלך תהליך האריזה.
סורבט srbent מוכן כמו שכבת סורבט משקעים בנפח ממס גדול. מעניין שהאריזה מבוססת פצצת הלחץ אינה דורשת את אותם תנאי אריזה עבור עמודה לעמודה. בפלאש-פייק, אנחנו אף פעם לא יודעים את הריכוז המדויק של סורבטים סביב הכניסה לעמוד. אי אפשר למדוד ולשלוט בדיוק, כפי שהוא גם משתנה במהלך תהליך האריזה. עם זאת, העמודות הסופיות עדיין ניתנות לשחזור4 ללא קשר לאופן שבו הושגה האריזה.
הבסיס לאריזה המהירה טמון בחוסר היציבות היעיל של כיפה סורבט. מסיבה זו, חשוב לשלוט sorbent נכנס נימי ולשמור על תנאי אי היציבות כיפה אופטימלית לאורך כל משך האריזה. קיימות מספר בעיות אפשריות שעשויות למנוע מסירת סורבט יעילה. כמה דוגמאות לכך הן resuspension שכבה סורבת על ידי סיבוב מוט מגנטי מהיר, חוסר יציבות כיפה לא יעילה עקב נימי יחסית שגויה למיקום מוט המגנט או סיבוב מוט מגנט איטי מדי. הנושאים עצמם וכיצד יש לטפל בהם נדונים בפירוט בסעיף הפרוטוקול.
לאחר אריזת העמודה, פרמטר העמודה העיקרי שיש לבדוק הוא הדחיסה האחורית של העמודה. ערכי הלחץ המפורטים בטבלה 5 מספק נקודת התייחסות למה שצפוי לאחד הפופולריים תת 2 מיקרומטר גודל חרוזים sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1.9 מיקרומטר). יחד עם זאת, לחץ אחורי נוסף עשוי להתווסף על ידי פריט או פולט משוך יותר מדי ויש לפקח כל הזמן על כך. אם האריזה נעשית לתוך פולט משוך, אנו עדיין מציעים למדוד את הדחיסה האחורית העמודה הצפויה עבור sorbent מסוים בשימוש על ידי אריזת נימים fritted הראשון, ולאחר מכן כדי לראות אם פריט הרכבה עצמית מוסיף יותר מדי. עבור בעיות בלחץ גבוה, השתמש בקווים המנחים המופיעים בטבלה 1 כדי להצביע על הבעיה.
מניסיוננו, טור ארוז ללא שינויי צבע, פערים, ועם הדחיסה האחורית הנכונה עובד ב -100% מהמקרים ונותן את איכות ההפרדה קרוב למה שניתן לצפות מאורך העמודה ומאפייני הסורבט. עמודה עם שינויי צבע אינה מובטחת לפעול כראוי, אך עדיין יכולה לתת תוצאות משביעות רצון.
רוב הזמן, אם יש בעיות עם איכות ההפרדה, הם לא באים מהטור עצמו, אלא מחלקים אחרים של מערכת ההפרדה, כלומר, משאבות, ממסים, או חיבורים. מזיק במיוחד הוא כל חיבורים לאחר עמודה. חיבור רע עם נפח מת בין המקרן לעמודה המקודשת מוביל להתרחבות שיא גדולה וזנב עקב שיעורי זרימה נמוכים מאוד בכרומטוגרפיה נימית.
נושא חשוב נוסף ספציפי לגישת FlashPack הוא שהיא משתמשת בהרבה סורבטים יקרים ב בקבוקון סורבט עובד. אנא זכור, כי סורבט srbent ב FlashPack מיועד לשימוש מרובה. תשמור על הסורבט. הימנעו ממגנט מיותר תוך ערבוב כדי להפחית את השחזה הסורבת- זכרו לעצור את הסיבוב ברגע שהאריזה מסתיימת. ואל תשאירו את מקטורן הסורבט הפתוח בפצצת הלחץ כדי למנוע ייבוש סורבט. למרות שעדיין ניתן להשתמש בסורבט לאחר מכן, לוקח זמן ליצור מחדש את ההסתה הסורבת.
השיטה עובדת באותה מידה עבור נימים fritted ונימים פולט משך. עיקרון FlashPack מגדיל את קצב האריזה של תעודות זהות נימיות מ-20 ל-250 מיקרומטר (קטנות וגדולות יותר לא נבדקו). זה חל גם על כל sorbents, הן נקבובי באופן מלא ושטחי, אנחנו יכולים לבדוק (המשקף כי היווצרות כיפה סורבט בריכוז srbent גבוה srbent אינו מוגבל במיוחד RP סורבטים). חוץ מזה, פרמטרים ממס משפיעים בבירור על האריזה על פי המאפיינים הפיזיים והכימיים שלהם. לדוגמה, פחות אצטון צמיג נותן שיעור אריזה גבוה עוד יותר מאשר מתנול באותו לחץ אריזה. עם זאת, הוא גם פחות קוטבי מאשר מתנול ומפחית חלקיקי סורבט דבק אחד לשני. ההשפעה כשלעצמה מונעת היווצרות כיפה סורבט בתחילת האריזה כאשר קצב הזרימה עדיין גבוה. עם זאת, הפחתת אינטראקציית חלקיקים סורבט מובילה גם להיווצרות פריט פחות אמין להרכיב עצמית וחסימה תכופה יותר משוך-סוף במהלך האריזה. אז, בעוד אצטון עדיף על אריזה של נימים fritted, זה פחות מתאים נימים פולט משך, עם מתנול כמו ממס ריר להיות איטי יותר אבל מתאים לשני סוגי הסוף. אריזה מהקסאן או דיכלורומתאן (DCM) הם מקרים קיצוניים של מעבר לאצטון ממתנול: הם אפילו פחות קוטביים, ולכן הם מונעים היווצרות כיפה סורבט לחלוטין, אולם הם אינם מתאימים לאריזת פולט משך בכלל. חוץ מזה, צוין כי קוטביות DCM נמוכה מאוד מוביל חלקיקי סורבט דבק בקיר נימי הפנימי ועושה שכבה עבה על זה. עובי השכבה גדל בהדרגה ובלוקים מקומיים אקראיים נוצרים וכתוצאה מכך העמודה ארוזה במספר חלקים המופרדים על-ידי אזורים ללא סורבט. השפעה כזו נצפתה C18 פפטיד אריס סורבט.
נושא נוסף שנצפה היה YMC Triart C18 סורבט לא מושעה במתנול כראוי, אלא כדי ליצור איזה פתיתים. עם זאת, זה לא מונע ממנו לקבל ארוז עם FlashPack ולתת יעילות הפרדה הגונה מאוד (נתונים שלא פורסמו). לכן, בעוד לא להיות אופטימלי עבור מקרים מסוימים, מתנול היה הממס האוניברסלי ביותר לעבוד עבור כל sorbents שנבדקו ועמודות. יש להזכיר כי עדיין לא לנתח איך ממיסים slurry שונים להשפיע על יעילות הפרדת העמוד. יחד עם זאת, היעילות של עמודות ארוזות מתנול כבר שווה לחלוטין לעמודות מסחריות עבור אותם סורבטים4.
FlashPack אינה הגישה הקיימת היחידה לשיפור קצב האריזה של עמודות UHPLC. אריזה מהירה מריכוז סורבט גבוה אפשרית גם עם שימוש באריזה בלחץ גבוה במיוחד7. היתרון של FlashPack הוא שזה הרבה יותר פשוט כפי שהוא אינו דורש משאבות לחץ אולטרה גבוה מיוחד ופצצות לחץ עבור משלוח סורבנט וחיבורים נימיים. יחד עם זאת, הוכח כי העמודים הארוזים בלחצים קיצוניים יכולים להיות יעילות הפרדה גבוהה יותר מאשר עמודות ארוזות בלחץ נמוך17. ובעוד FlashPack מייצר עמודות זהות לאלה מסחריים המשמשים בהשוואה4, אשר איננו יודעים את שיטת האריזה, זה עדיין לא נבדק איך עמודות FlashPack לעמוד נגד עמודות ארוזות בלחץ גבוה במיוחד.
לסיכום, ניתן להתאים בקלות את שיטת FlashPack המתוארת לפרוטוקול האריזה הקיים במעבדה עם כמה התאמות שבוצעו לפרוטוקול, בעוד ההתקנה נשארת זהה לחלוטין. הוא מאיץ את אריזת העמודות הנימיות של HPLC לזמן של דקות ומאפשר ייצור של עמודות נימיות ארוכות של UHP, דבר שהוא בלתי אפשרי בעליל עם הליך האריזה הסטנדרטי. ניתן לספור את הכלכלה הכוללת בזמן ובכסף למעבדה על ידי יישום גישת FlashPack בעשרות אלפי יורו בשנה. בנוסף, היכולת לייצר עמודות נימי UHP באופן מקומי פותחת את האפשרויות להתאמה אישית של ניסויים בלתי אפשרית עם המוצרים המסחריים הזמינים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי מענק RSF 20-14-00121. המחברים מודים ל- P. V. Shliaha (מרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג) על דיונים פוריים.
Materials
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2×5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- . Pressure injection cells – next advance – laboratory instruments Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021)
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
