Einfache Inhouse-Herstellung von Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen mit dem FlashPack-Ansatz

Das Packprotokoll besteht aus fünf Schritten(Abbildung 1):1) Vorbereitung der Packstation, 2) Kapillarvorbereitung, 3) Vorbereitung der Sorptionsschlämme, 4) Kapillarpackung in der Druckbombe und 5) Säulenaufpackung im HPLC-System, Schneiden auf die Größe und UHPLC-Verbindungsinstallation. Die FlashPack-Optimierung erfordert Anpassungen in den Abschnitten 3 und 4 im Vergleich zum gemeinsamen Protokoll. 1. Montage der Packstation Bereiten Sie einen Gastank vor, der entweder mit Stickstoff, Helium oder Argon gefüllt ist und mit einem einstufigen Gasregler mit einem Ausgangsdruck > 50 bar ausgestattet ist. Der maximale Druck wird durch die Druckbombenkompatibilität begrenzt. Schließen Sie den Regler an das Entlüftungsventil der Druckbombe an. Wenn die Druckbombe nicht mit einem integrierten Magnetrührer ausgestattet ist, platzieren Sie die Bombe auf einem Magnetrührer. Schließen Sie einen schmalen ID-Kunststoffschlauch (z. B. 0,13 mm) an den Entlüftungsauslass der Druckbombe an und legen Sie ihn in einen Behälter mit Wasser. 2. Kapillarpräparation Bereiten Sie eine gefrittene Kapillare mit einer integrierten Glasfritte aus Kasil und Formamid15 oder einer gezogenen Emitterkapillare vor, die durch einen Laserzieher16hergestellt wird. Die Kapillare ist 10-15 cm länger als die vorgesehene Säulenlänge.HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Erörterung möglicher Probleme im Zusammenhang mit verschiedenen Kapillargrößen und Frittentypen. Tabelle 2 enthält ein Beispiel für ein P2000-Laserzieherprogramm zur Herstellung von Pulled-Emitter-Kapillaren. Schützen Sie ein gezogenes Emitterende mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze mit Gelbeladung. Schneiden Sie die Spitze so, dass sie eng um die 360 μm OD-Kapillare passt (sie kann entlang der Kapillare bewegt werden, erfordert jedoch einige Anstrengungen). Schieben Sie die geschnittene Pipettenspitze aus Richtung des Kapillarvorderendes auf die Kapillare und bewegen Sie sie bis zum Emitterende. Schieben Sie die Schutzspitze zurück, wenn die Säule sprüht. Schieben Sie die Spitze nach vorne, um das Emitterende in der Spitze zu haben, wenn die Säule nicht sprüht (auch wenn sich die Säule unter dem Durchfluss befindet, aber immer noch nicht sprüht). 3. Sorptionsschlämmbereitung Bereiten Sie eine Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor: Geben Sie ~ 50 mg trockenes Sorptionsmittel in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Hier wird Reprosil Pur C18 als Beispiel verwendet. 1 ml Methanol in das Sorptionsröhrchen geben. Um es vollständig zu mischen, wirbeln Sie das Rohr für 10 s mit einem Wirbelmischer. Beschallung in einem Beschallungsbad für 10 s. Lassen Sie das Sorptionsmittel 20-30 min gründlich einweichen. Dann wirbeln Sie es noch einmal und beschallen Sie es. Bereiten Sie eine funktionierende Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor. Verwenden Sie eine konische Bodenfläschchen, die in die Bombe passt.HINWEIS: Es kann sich entweder um ein weiteres 1,5-ml-Zentrifugenrohr oder ein anderes Fläschchen handeln, abhängig von der jeweiligen Druckbombenkonstruktion. Für dieses Experiment wird ein konisches unteres Schraubverschlussrohr verwendet, das auf die Höhe der Druckbombe zugeschnitten ist. Resuspendieren Sie das Sorptionsmittel in der Durchstechflasche mit Sorptionsmittel und geben Sie 500 μL in die Arbeits-Sorptionsflasche mit einer Magnetstange von 2 x 3 mm Größe. Methanol bis zu ~ 1 ml in die Arbeitsflasche geben. Lassen Sie das Arbeitsfläschchen 10 Minuten auf dem Tisch stehen, damit sich das Sorptionsmittel durch Schwerkraft absetzt. Wenn die Sorptionsschicht nach dem Absetzen unter 4 mm liegt, fügen Sie mehr von der Sorptionsschlämme hinzu und warten Sie, bis sich das Sorptionsmittel für weitere 10 minuten abgesetzt hat.ANMERKUNG: Die vorbereitete Arbeitsfläschchen ist für die Vorbereitung mehrerer Säulen über Monate bestimmt. Wenn die Arbeitssubstechflasche länger als 2 h ohne Rühren bleibt, muss sie 10 s lang gewirbelt, 10 s lang beschallt und durch Schwerkraft abgesetzt werden. Routinemäßig wird das Sorptionsmittel am Morgen vor dem Packen resuspendiert. Dann ist es gut für das Packen für den ganzen Tag, wenn es keine langen Pausen zwischen dem sequentiellen Spaltenpacken gibt. Wenn das Sorptionsmittel in der Arbeitsfläschchen austrocknet, fügen Sie Methanol hinzu und führen Sie das vollständige Sorptionsmittelvorbereitungsverfahren wie bei der Durchstechflasche mit Stammsorbens durch (Schritte 3.2-3.5). 4. Kapillarpackung in einer Druckbombe ACHTUNG: Tragen Sie bei der Arbeit mit der Druckbombe immer eine Schutzbrille. Tragen Sie keine Handschuhe. Diese reduzieren den Tastsinn, der für den richtigen Umgang mit Kapillaren mit kleinem Durchmesser erforderlich ist, erheblich und führen zu Fehlern. Legen Sie die Durchstechflasche in die Druckbombe und befestigen Sie alle Muttern fest. Starten Sie die Rotation mit 60-100 U / min. Führen Sie die gestreue oder gezogene Emitterkapillare in die Bombe ein: Drücken Sie sie bis zum Boden der Durchstechflasche, heben Sie sie dann 2-3 mm hoch und befestigen Sie die Mutter.HINWEIS: Wenden Sie eine minimal erforderliche Kraft an, um die Kapillare zu fixieren, um Kapillar- und Ferrulenschäden zu vermeiden. Das Beste ist das Anziehen von Hand. Wenn ein Sechskantschlüssel verwendet wird, wenden Sie einen minimalen ausreichenden Kraftaufwand für das Anziehen an. Überprüfen Sie, ob die Kapillare richtig fixiert ist – es muss unmöglich sein, die Kapillare zu bewegen, indem Sie sie von Hand herausziehen. Öffnen Sie das Druckbombenventil sehr langsam, während Sie das offene Ende der Kapillare vom Gesicht weg zeigen. Beobachten Sie die ersten Schritte des Verpackungsprozesses.HINWEIS: Unmittelbar nach der Druckbeaufschlagung füllt das Sorptionsmittel die Kapillare und wird für die gesamte Länge undurchsichtig. Sobald sich das Sorptionsmittel im distalen Ende einzupacken beginnt, nimmt der Gegendruck zu, der Fluss verlangsamt sich und die gleichmäßige Sorptionsschlämme in der Kapillare bildet sich in mehrere Sorptionsmittelpakete um, die durch sorptionsmittelfreie Lücken getrennt sind. Bereits gepacktes Sorptionsmittel ist als dicht gefärbtes, kontinuierlich wachsendes Gebiet sichtbar. Halten Sie die mit Sorptionsmittel gefüllten Bereiche während der gesamten Dauer des Verpackungsprozesses mindestens 70% der Kapillarlänge mit kleinen sorbentienfreien Lücken. Es gibt mehrere häufige Probleme, die während des Verpackungsprozesses zu beachten sind, die eine Anpassung des Setups während des Fluges erfordern, um eine effiziente Sorptionsmittelabgabe in die Kapillare zu gewährleisten.ANMERKUNG: Weitere Einzelheiten zur Einstellung der Sorptionsmittelabgabeeffizienz sind in Tabelle 3 beschrieben. Problem 1: Wenn das neue Sorptionsmittel nicht mehr in die Kapillare gelangt, während sich das bereits im Inneren befindliche Sorptionsmittel weiter bewegt, führen Sie die folgenden Schritte aus.HINWEIS: Dies ist das häufigste Problem. In den meisten Fällen wird der Kapillareingang durch selbstaggregierende Sorptionscluster blockiert. Wenden Sie die folgenden Schritte nacheinander an, bis der Sorptionsmittelfluss wiederhergestellt ist, und überspringen Sie dann die restlichen problembezogenen Schritte. Erhöhen Sie die Drehzahl auf 500 U / min und reduzieren Sie sie sofort wieder auf 60-100 U / min. Normalerweise stellt es den Sorptionsmittelfluss wieder her. Überprüfen Sie die Drehzahl für den Rest des Verpackungsprozesses auf mindestens 60 U / min. Wenn es nicht hilft, entlüften Sie die Packbombe kurz und setzen Sie sie sofort wieder unter Druck. Wenn es nicht hilft oder die Blockierung erneut auftritt, positionieren Sie die Kapillare innerhalb der Sorptionsschicht neu. Das Fehlen des Sorptionsmittels kann darauf zurückzuführen sein, dass das offene Kapillarende entweder zu hoch über der Magnetstange liegt, so dass das Säulenende es nicht berührt, oder dass die Kapillare in den Boden der Durchstechflasche einklebt. Entlüften Sie zuerst die Bombe vollständig, lösen Sie die Mutter, drücken Sie die Kapillare nach unten und ziehen Sie sie dann 2 mm zurück. Befestigen Sie die Mutter. Wenn die Blockierung anhält, entlüften Sie das System, nehmen Sie die Durchstechflasche und den Wirbel heraus und beschallen Sie es erneut. Überprüfen Sie das kapillare frontale Ende auf Beschädigungen unter dem Mikroskop und schneiden Sie bei Bedarf ~ 5 mm des vorderen Endes ab. Problem 2: Wenn das Sorptionsmittel nur einen kleinen Teil der Kapillare mit langen leeren Bereichen füllt, führen Sie die folgenden Schritte aus. Überprüfen Sie die Drehzahl. Wenn die Rotation zu langsam ist, ist der Kuppelbruch nicht effizient genug. Erhöhen Sie die Drehzahl auf ~150 U/min. Wenn die Rotation zu schnell ist, wird das Sorptionsmittel in das größere Fläschchenvolumen resuspendiert und die lokale Sorptionsmittelkonzentration um den Säuleneingang ist niedrig. Verlangsamen Sie die Drehzahl auf 60-100 U / min. Überprüfen Sie den Sorptionsmittelspiegel. Das gleiche Problem mit wenig Sorbens in der Kapillare wird beobachtet, wenn nicht genügend Sorptionsmittel in der Durchstechflasche vorhanden ist. Wenn das Sorptionsmittel aufgebraucht ist, füllen Sie die Durchstechflasche mit dem neuen Sorptionsmittel, um die Sorptionsschicht nach schwerkraftinduziertem Absetzen nicht weniger als 4 mm hoch zu halten. Packen Sie die Säule weiter, bis die Zielsäulenlänge plus 5-7 cm erreicht ist. Stoppen Sie die Rotation und verringern Sie die Bombe sehr langsam. Öffnen Sie das Bombenventil ein wenig und warten Sie, bis die Blase in der Wasserflasche platzt. Öffnen Sie dann das Ventil etwas weiter und warten Sie erneut, bis die Blase platzt. Geben Sie den Druck in Schritten ab, bis kein Gas mehr aus dem Ventil austritt.HINWEIS: Öffnen Sie das Ventil nicht ganz auf einmal – es führt zu einem Blubbern in der Kapillare und dem Sorptionsmittel, das zurück in die Durchstechflasche gelangt. Wenn das passiert, setzen Sie die Bombe unter Druck und warten Sie, bis die Säule wieder gepackt ist. Wenn das Gas nicht mehr aus dem Entlüftungsventil kommt, nehmen Sie die gepackte Kapillare aus der Druckbombe.HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht austrocknen. Wenn sie nicht sofort zur weiteren Verpackung an das HPLC-System angeschlossen sind, lagern Sie die verpackte Kapillare ein, indem Sie sie vollständig in 10% ige EtOH-Lösung tauchen. Ein flüssigkeitsdichter Lebensmittelbehälter aus Polypropylen kann für die Kapillarlagerung verwendet werden. Getrennte HPLC-Säulen werden auf die gleiche Weise gespeichert. Wenn keine weitere Verpackung geplant ist, nehmen Sie das Sorptionsmittel aus der Bombe heraus und verschließen Sie es fest. Bewahren Sie es für weitere Säulenverpackungen auf. 5. Verpackung in der HPLC-Säule Verbinden Sie die gepackte Kapillare über eine HPLC-Verbindung mit dem HPLC-System. Beginnen Sie den Durchfluss mit 95% Lösungsmittel B (80 oder 100% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure (FA)) mit einem Druck von 250-300 bar. Für 40 cm gepackte Kapillare verwenden Sie die Durchflussrate von 200-300 nL / min.HINWEIS: Der Packungsdurchfluss beträgt 200 nL/min für eine 40-50 cm Säule mit 100 μm ID, verpackt mit 2 μm Sorbens. Einige andere Spaltengrößen sind in Tabelle 4aufgeführt. Durchflussraten für andere Säulenlängen und IDs werden aus der direkten Proportionalität zwischen dem Gegendruck und der Säulenlänge und dem Querschnitt geschätzt. Die genaue Durchflussmenge wird an die tatsächliche Packlänge angepasst, die standardmäßig länger ist als die angestrebte Spaltenlänge. Beachten Sie auch, dass der Druck von 300 bar auf die physikalische Druckgrenze der HPLC-Verbindung abzielt. Für Verbindungen mit höherem Druck sind höhere Durchflussmengen bis zur Anschlussdruckgrenze für ein schnelleres Packen zu verwenden. Achten Sie darauf, dass das lose Sorbens in der Kapillare verpackt und zur Gesamtpacklänge hinzugefügt wird. Ohne den Fluss zu stoppen, tauchen Sie den Säulenkörper zweimal in das Beschallungsbad ein.HINWEIS: Tauchen Sie Säulenenden und Kapillarverbindungen nicht ein – nur einen Teil des Säulenkörpers. Der Ultraschallschritt trägt zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Säulen bei, insbesondere bei extrem langen Säulen >50 cm Länge (unveröffentlichte Daten); Es fügt jedoch eine zufällige Chance hinzu, die sich selbst zusammensetzende Sorptionsköder fritte innerhalb des Emitterendes der gezogenen Emitterkapillare zu brechen und die Säule vollständig zu blockieren. Während die Beschallung universell auf jede glasbedeckte Säule angewendet werden kann, empfehlen wir, gezogene Emittersäulen nur für die Säulenlänge > 50 cm zu beschallen. Wenn das Sorptionsbett aufhört zu schrumpfen, tauchen Sie den Säulenkörper noch zweimal in das Beschallungsbad ein, ohne den Fluss zu stoppen. Führen Sie die Säule weitere 10 Minuten bei 300 Balken aus. Stoppen Sie den Durchfluss, warten Sie, bis der Druck auf unter drei bar gesunken ist, und trennen Sie die Säule. Überprüfen Sie die Säule visuell auf fehlende Lücken und Verfärbungen. Wenn welche gefunden werden, kann die Beschallung unter der Strömung wiederholt werden. Erwägen Sie für kritische Experimente, eine neue Spalte zu erstellen. Schneiden Sie die Spalte auf die gewünschte Länge aus.HINWEIS: Richtig ausgeführtes Schneiden ist eine Voraussetzung für die Säuleneffizienz. Machen Sie eine Kerbe in Polyimidbeschichtung mit dem Schreiber, knacken Sie teilweise die Kapillare und ziehen Sie zwei Stücke auseinander. Polieren Sie die Säulenfront auf einem Keramikwafer oder mit Läppfolie. Schließen Sie die Säule über eine UHPLC-Verbindung wieder an das LC-System an. Beginnen Sie die Arbeitsflussrate bei 2% B in Abhängigkeit von der Spalten-ID gemäß Tabelle 4. Warten Sie, bis sich der Druck ausgeglichen hat, und überprüfen Sie den Säulengegendruck.HINWEIS: Der Arbeitsdurchfluss wird entsprechend den Spaltenparametern angepasst. Beispielsweise wird eine 30 cm lange 100 μm ID-Säule mit 500 nL/min betrieben. Stellen Sie sicher, dass der Gegendruck innerhalb von 5 % des erwarteten Wertes liegt (siehe Tabelle 5),um zu bestätigen, dass die Spalte ordnungsgemäß gepackt und einsatzbereit ist.HINWEIS: Der Säulengegendruck ist der Gesamtdruck im Gradientenkanal des HPLC-Systems mit angeschlossener Säule abzüglich des Gegendrucks der Kapillaren vor der Säule. Gleichzeitig sind die Werte in Tabelle 5 willkürlich (sie geben eine beliebige Skala dessen an, was zu erwarten ist). Die laborinterne Ähnlichkeit des Gegendrucks von Säule zu Säule ist ein wichtigerer Indikator dafür, dass alles richtig funktioniert. Der tatsächliche absolute Gegendruck hängt von vielen Parametern ab, wie z.B. der Sorptionsmittelgröße und -eigenschaften, der Kapillar-ID, Hersteller und Charge, der Form des gezogenen Emitterendes oder der Dichte und Länge der Glasfritte, den Lösungsmitteleigenschaften und der Umgebungstemperatur im Raum usw. Wenn der Gegendruck zu hoch ist, siehe Tabelle 1 für mögliche Probleme.