使用FlashPack方法进行简单的内部超高性能毛细管柱制造

填料方案包括五个步骤（图1）：1）填料站准备，2）毛细管制备，3）吸附剂浆料制备，4）毛细管填料在压力弹中，5）柱填料在HPLC系统中，切割到尺寸和UHPLC连接安装。与通用协议相比，FlashPack 优化需要在第 3 节和第 4 节中进行调整。 1. 包装站组装 准备一个充满氮气，氦气或氩气的气罐，配有单级气体调节器，出口压力>50巴。最大压力受压力炸弹兼容性的限制。 将调节器连接到压力炸弹的排气阀。 如果压力炸弹没有配备集成式磁力搅拌器，请将炸弹放在磁力搅拌器上。 将窄ID塑料管（例如，0.13 mm）连接到压力炸弹的排气口，并将其放入装有水的容器中。 2. 毛细管准备 用由Kasil和甲酰胺15 形成的集成玻璃熔块或由激光拉拔器16制备的拉动发射器毛细管制备的熔块毛细管。毛细管比预期的柱长10-15厘米。注：有关与不同毛细管尺寸和色釉类型相关的可能问题的讨论，请参见表 1。表2包含用于制造拉射发射器毛细管的P2000激光拉拔器程序的示例。 使用切割的凝胶加载移液器吸头保护拉动的发射器端。 切开尖端，使其紧紧地贴合在360μm外径毛细管周围（它可以沿着毛细管移动，但需要一些努力才能做到这一点）。 将切割的移液器尖端从毛细管前端的方向滑到毛细管上，然后将其向上移动到发射器端。 当色谱柱喷洒时，将保护尖端滑回。向前滑动吸头，使发射极端在色谱柱未喷涂时（即使色谱柱在流动下方，但仍未喷涂）。 3. 吸附剂浆料制备 准备储备吸附剂小瓶：将约50mg干吸附剂放入1.5mL离心管中。这里，以Reprosil Pur C18为例。 向吸附剂管中加入1 mL甲醇。 要完全混合它，请使用涡旋混合器涡旋管10秒。 在超声浴中超声处理10秒。 让吸附剂彻底浸泡20-30分钟。然后，再次涡旋并超声处理它。 准备一个有效的吸附剂小瓶。使用适合炸弹的锥形底部小瓶。注意：它可以是另一个1.5 mL离心管或任何其他小瓶，具体取决于特定的压力炸弹设计。对于该实验，使用锥形底部螺旋盖管切割到压力炸弹的高度。 将吸附剂重悬于储备吸附剂小瓶中，并将500μL转移到具有2 x 3 mm尺寸的磁条的工作吸附剂小瓶中。 向工作瓶中加入甲醇至~1 mL。 让工作小瓶在桌子上放置10分钟，使吸附剂在重力作用下沉降。 如果在沉降后，吸附剂层低于4毫米，则加入更多的储备吸附剂浆料，并等待吸附剂再沉降10分钟。注：制备的工作瓶用于在几个月内制备多个色谱柱。如果工作吸附剂小瓶在不搅拌的情况下停留超过2小时，则必须涡旋10秒，超声处理10秒并通过重力沉降。通常，吸附剂在早上包装前重新悬浮。然后，如果顺序柱包装之间没有长时间的停顿，则适合全天包装。如果工作小瓶中的吸附剂变干，则加入甲醇，并像浆料吸附剂小瓶一样运行完整的吸附剂制备程序（步骤3.2-3.5）。 4. 压力炸弹中的毛细管填料 注意：使用压力炸弹时，请始终佩戴防护眼镜。不要戴手套。这些严重降低了正确处理小直径毛细管所需的触觉，并导致错误。 将吸附剂小瓶放入压力炸弹中，并紧紧固定所有螺母。 以 60-100 rpm 开始旋转。 将熔块或拉动的发射器毛细管插入炸弹：将其推到小瓶的最底部，然后将其向上提起2-3毫米并固定螺母。注：施加最小所需力来固定毛细管，以避免毛细管和套圈损坏。最好的是用手拧紧。如果使用六角扳手，请用最少的力气拧紧。 检查毛细管是否正确固定 – 用手将其拉出必须无法移动毛细管。 非常缓慢地打开压力弹阀，同时保持毛细管的开口端远离您的脸部。 观看包装过程的初始步骤。注意：加压后，吸附剂立即充满毛细管，并且在整个长度上变得不透明。一旦吸附剂开始在远端内包装，背压增加，流量减慢，毛细管内的均匀吸附剂浆液改造成几个吸附剂包，由无吸附剂间隙隔开。已经填充的吸附剂可见为颜色浓密的持续生长区域。 在整个包装过程中，保持吸附剂填充区域至少为毛细管长度的70%，并留有小的无吸附剂间隙。 在包装过程中有几个常见问题需要注意，这些问题需要在飞行中调整设置，以保持吸附剂的有效输送到毛细管中。注：有关吸附剂输送效率调整的更多详细信息，请参见表3。 问题1：当新的吸附剂停止进入毛细管，而已经存在的吸附剂继续移动时，请按照以下步骤操作。注意：这是最常见的问题。在大多数情况下，毛细管入口被自聚集的吸附剂簇阻塞。逐个应用以下步骤，直到吸附剂流恢复，然后跳过其余与问题相关的步骤。 将转速提高到 500 rpm，并立即将其降低到 60-100 rpm。通常，它恢复吸附剂流动。检查包装过程其余部分的转速是否至少为60 rpm。 如果它没有帮助，请短暂地发泄包装炸弹并立即将其加压。 如果它没有帮助或再次发生阻塞，请将毛细管重新定位在吸附剂层内。没有吸附剂可能是由于毛细管开口端在磁棒上方太高，因此柱端不接触它，或者毛细管粘入小瓶底部。首先，将炸弹完全排空，松开螺母，将毛细管推到底部，然后将其向后拉2毫米。固定螺母。 如果阻塞仍然存在，请排出系统，取出吸附剂小瓶并涡旋并再次超声处理。在显微镜下检查毛细管前端是否损坏，并在需要时切割约5mm的前端。 问题2：当吸附剂仅填充毛细管的一小部分具有长空区域时，请按照以下步骤操作。 检查转速。如果旋转太慢，冲天炉断裂效率不够高。将转速增加到 ~150 rpm。 如果旋转速度过快，吸附剂将重悬到较大的小瓶体积中，并且柱入口周围的局部吸附剂浓度较低。将转速减慢至 60-100 RPM。 检查吸附剂水平。当小瓶中没有足够的吸附剂时，毛细管内几乎没有吸附剂时观察到同样的问题。当吸附剂用完时，用新的吸附剂填充小瓶，以便在重力诱导沉降后保持吸附剂层不低于4毫米高。 继续包装色谱柱，直到达到目标色谱柱长度加 5-7 厘米。 停止旋转，非常缓慢地给炸弹减压。 稍微打开炸弹阀，等待水瓶内的气泡破裂消退。然后，将阀门打开一点，再次等待气泡破裂减慢。 以增量方式释放压力，直到没有气体从阀门中排出。注意：不要一次一直打开阀门 – 这会导致毛细管内部冒泡，吸附剂会回到小瓶中。如果发生这种情况，请向炸弹加压，等待柱子再次装满。 当气体停止从排气阀中流出时，将填充的毛细管从压力炸弹中取出。注：不要让色谱柱变干。如果未立即连接到HPLC系统进行进一步包装，请将包装好的毛细管全部浸入10%EtOH溶液中储存。液密聚丙烯食品储存容器可用于毛细管储存。断开连接的HPLC色谱柱以相同的方式存储。 如果没有进一步的包装计划，请从炸弹中取出吸附剂小瓶并紧紧关闭。请保留它以进行进一步的色谱柱包装。 5. 在高效液相色谱柱中包装 通过HPLC 连接将填充的毛细管连接到 HPLC 系统。 在95%溶剂B（80或100%乙腈，0.1%甲酸（FA））下开始流动，目标是250-300 bar压力。对于40厘米包装的毛细管，使用200-300 nL / min的流速。注：对于 40-50 cm 柱，100 μm 内径填充有 2 μm 吸附剂的填料流量为 200 nL/min。 表 4中列出了其他一些列大小。其他柱长和ID的流速是根据背压与柱长和横截面之间的直接比例来估计的。精确流速调整为实际包装长度，默认情况下，该长度比目标柱长度长。另请注意，300 bar 压力的目标是 HPLC 连接的物理压力极限。对于较高压力的连接，应使用高达连接压力极限的较高流量，以实现更快的包装。 注意毛细管内松散的吸附剂是否被包装并添加到总包装长度中。 在不停止流动的情况下，将柱体浸入超声处理浴中两次。注：请勿浸没柱端和毛细管连接 – 仅浸入柱体的一部分。超声处理步骤有助于提高色谱柱的再现性，特别是对于>50厘米长的极长色谱柱（未发表的数据）;然而，它增加了一个随机的机会，即破坏拉动的发射器毛细管的发射器端内的自组装吸附剂色釉并完全阻塞柱子。虽然超声处理可以普遍应用于任何玻璃熔块柱，但我们建议仅在柱长>50厘米时对拉动的发射器柱进行超声处理。 当吸附床停止收缩时，将柱体浸入超声处理槽中两倍而不停止流动。 在 300 根柱上再运行 10 分钟。 停止流动，等待压力降至三巴以下，然后断开色谱柱。 目视检查色谱柱是否有间隙和变色。如果发现任何，可以在流动下重复超声处理。对于关键实验，请考虑制作一个新列。 将列剪切到所需的长度。注：正确切割是色谱柱效率的先决条件。用划线器在聚酰亚胺涂层中做一个缺口，部分裂开毛细管并将两块拉开。 在陶瓷晶圆上或用研磨膜抛光柱前端。 使用 UHPLC 连接将色谱柱重新连接到 LC 系统。 根据 表4的列ID，工作流量从2%B开始。等待压力平衡并检查柱背压。注：工作流量根据色谱柱参数进行调整。例如，一个30厘米长的100μm ID柱以500 nL / min的速度运行。 确保背压在预期值的5%以内（见 表5），这确认了色谱柱包装正确并准备使用。注：色谱柱背压是HPLC系统梯度通道中的总压力，与色谱柱连接在一起减去柱前毛细管的背压。同时， 表 5 中的值是任意的（它们给出了预期的任意比例）。实验室内各色谱柱背压的相似性是一切正常运转的更重要指标。实际的绝对背压取决于许多参数，例如吸附剂尺寸和特性，毛细管ID，制造商和批次，拉出发射器端的形状或玻璃釉料的密度和长度，溶剂特性和室内环境温度等。如果背压过高，请参阅 表 1 以了解可能的问题。