بسيطة في المنزل فائقة الأداء تصنيع العمود الشعرية مع نهج FlashPack
Summary
هنا نقدم بروتوكولا لإجراء التعبئة العمود الشعرية FlashPack الأمثل. تطبيق بروتوكول الأمثل لإعداد قنبلة ضغط 100 بار مشترك يسمح التعبئة أسرع 10 مرات وتصنيع أعمدة الشعرية طويلة فائقة الأداء.
Abstract
يعتبر التصوير الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء (UHPLC) حاليا طريقة مفضلة لخطوة فصل العينة في البروتيوميات المستندة إلى LC-MS. ومع ذلك، الأعمدة الشعرية هي أقل قوة بكثير بالمقارنة مع الأنواع المضادة تدفق أعلى. بسبب التلوث السهل والحجب ، فإنهم يحتاجون في كثير من الأحيان إلى الاستبدال. وهذا يجعلها جزءا مكلفا بشكل ملحوظ من إجمالي تكلفة تحليل LC-MS. التعبئة الداخلية للأعمدة الشعرية UHPLC يوفر الكثير من المال ويسمح بالتخصيص. ومع ذلك ، فإن إجراء التعبئة القياسي في قنبلة الضغط 100 بار يعمل بشكل جيد فقط لأعمدة HPLC ولكنه بطيء للغاية بالنسبة لمتمتز UHPLC. هنا نقدم وصفا لبروتوكول FlashPack الأمثل المطبق على نفس الإعداد قنبلة الضغط 100 بار. وتستند هذه الطريقة على التعبئة من الطين تركيز المواد الماصة عالية جدا ويتم تطويرها لتصنيع في المنزل من الأعمدة الشعرية UHPLC من طول غير محدود في وقت معقول.
Introduction
ويستند البروتيوميات الحديثة على قياس الطيف الكتلي السائل المقترن بالكروماتوغرافيا مع الكروماتوغرافيا فائقة الأداء نانو تدفق (50-150 ميكرومتر قطر العمود الداخلي (ID)) فصل توفير أفضل سرعة التحليل والحساسية1. في حين تتوفر العديد من الأعمدة الشعرية التجارية UHPLC ، فإن سعرها يشكل جزءا كبيرا من تكلفة المواد الاستهلاكية ، خاصة عندما يتم تشغيل مشاريع متعددة ومتنوعة في المختبر ويعد تلوث الأعمدة الخاصة بالمشروع مشكلة متكررة. إلى جانب ذلك ، تسمح تعبئة الأعمدة الداخلية باستخدام المواد الماصة المخصصة للتجربة (مثل ، polyCAT-A sorbent2)وخصائص العمود غير المتاحة للشراء كعمود جاهز.
للتعامل مع ذلك ، العديد من المختبرات حزمة أعمدة شعرية في المنزل. ومع ذلك ، فإن إجراء التعبئة الشائعة مع قنبلة ضغط شريط 100(خلية حقن الضغط) 3 غير مناسب لتعبئة عمود UHPLC بسبب الضغط الخلفي العالي لمتمتزات UHPLC الفرعية 2 ميكرومتر مما يؤدي إلى انخفاض كبير في معدل التعبئة بالمقارنة مع المواد الماصة HPLC أكبر حجما. في حين أن أعمدة UHPLC القصيرة لا تزال معبأة ببطء شديد ، فإن تصنيع أعمدة UHPLC الطويلة مستحيل فعليا4.
تتم التعبئة عمود الشعرية القياسية في ضغوط منخفضة نسبيا تصل إلى 100 أشرطة، ومع تركيز الطين ماصة منخفضة جدا. ومن ثم، هناك اتجاهان محتملان لتسريع العملية. فمن الممكن لزيادة ضغط التعبئة5. ومع ذلك، يتطلب ذلك معدات خاصة، وعمليا، تركيب طريقة جديدة في المختبر. طريقة أخرى هي زيادة تركيز الطين الماصة6. ويرد وصف ارتفاع التعبئة تركيز الطين ماصة في تركيبة مع الضغط التعبئة عالية جدا في منشور سابق7. ومع ذلك ، في ضغط 100 شريط ، والذي يستخدم في معظم قنابل التعبئة الموجودة ، يؤدي تركيز المواد الماصة الأعلى إما إلى إبطاء معدل التعبئة أو التوقف التام عن التعبئة. وقد ثبت مؤخرا أن التأثير يرجع إلى تجمع ماصة عند مدخل العمود، واقترح خدعة بسيطة من زعزعة استقرار قبة ماصة عن طريق طرق مدخل العمود مع شريط المغناطيس داخل قارورة ماصة4. تستخدم الطريقة الناتجة ، المسماة FlashPack ، نفس إعداد تعبئة قنبلة الضغط 100 بار. وفي الوقت نفسه، تسمح التغييرات الطفيفة ولكن الحرجة في إجراء التعبئة بالتعبئة من تركيز ملوث عالي جدا وإنتاج أعمدة UHPLC طويلة جدا (50 إلى 70 سم، وأطول) في أقل من ساعة، في حين يمكن إنتاج عمود قصير في دقائق مع جودة الفصل مساوية للأعمدة التجارية لنفس المعلمات4. تم استخدام نهج FlashPack بنجاح في مشاريع بروتيوميات متعددة لإعداد كل من المرحلة العكسية (RP)8و9و10و11و12و13و14 والتفاعل المائي (HILIC)2 أعمدة شعرية.
هنا نحن نصف بالتفصيل ، والتعديلات اللازمة للتكيف مع نهج FlashPack لمعايير 100 بار ضغط قنبلة التعبئة الإجراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعبئة في المنزل عمود شعري تحظى بشعبية كبيرة في المختبرات الكبيرة التي تعمل على مشاريع مستقلة متعددة. ومع ذلك، فإن طريقة التعبئة الشائعة من تعليق ماصة منخفض التركيز لها قيود كبيرة في السرعة وغير قادرة على إنتاج أعمدة UHPLC طويلة.
FlashPack هو تعديل لإجراءات التعبئة القياسية مما يجعل التعبئة من تركيز ماصة عالية جدا ممكن. الأساس النظري للطريقة يكمن في زعزعة استقرار القبة الماصة المستمرة عند مدخل العمود طوال مدة التعبئة. ويتحقق هذا الأخير من الناحية الفنية عن طريق مدخل العمود يجري ضرب باستمرار مع شريط المغناطيس. تم تطوير طريقة زعزعة استقرار القبة عمدا لجعل إعداد التعبئة مشابها تماما لعملية التعبئة الشائعة ، ولكن خدعة FlashPack تكمن في تفاصيل إعداد الطين الماصة ، وتحديد المواقع الشعرية ، واستخدام شريط المغناطيس أثناء عملية التعبئة.
يتم إعداد الطين الممتز كطبقة ماصة للرواسب في حجم مذيب كبير. ومن المثير للاهتمام أن التعبئة القائمة على قنبلة الضغط لا تتطلب نفس شروط التعبئة لعمود إلى عمود. في FlashPack ، لا نعرف تركيز الطين الممتز الدقيق حول مدخل العمود. من المستحيل قياس ومراقبة بالضبط، كما أنه يتغير أيضا أثناء عملية التعبئة. ومع ذلك، فإن الأعمدة النهائية لا تزال قابلة للاستنساخ جدا4 بغض النظر عن كيفية تحقيق التعبئة.
الأساس للتعبئة السريعة يكمن في كفاءة زعزعة استقرار قبة ماصة. لهذا السبب، من المهم السيطرة على المواد الماصة دخول الشعرية والحفاظ على ظروف زعزعة الاستقرار القبة الأمثل طوال مدة التعبئة بأكملها. هناك العديد من القضايا المحتملة التي قد تمنع تسليم المواد الماصة كفاءة. بعض الأمثلة على هذه هي إعادة تعليق طبقة ماصة عن طريق دوران شريط مغناطيسي سريع، وعدم كفاءة زعزعة استقرار القبة بسبب إما الشعيرات الدموية النسبية خاطئ لتحديد المواقع شريط المغناطيس أو دوران شريط المغناطيس بطيئة جدا. وتناقش المسائل ذاتها وكيفية معالجتها بالتفصيل في قسم البروتوكول.
بعد حزم العمود، معلمة العمود الرئيسي للتحقق هو backpressure العمود. توفر قيم الضغط المدرجة في الجدول 5 نقطة مرجعية لما هو متوقع لأحد أحجام حبة 2 ميكرومتر الفرعية الشائعة sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1.9 ميكرومتر). في الوقت نفسه ، يمكن إضافة ضغط خلفي إضافي بواسطة frit أو باعث سحب ضيق للغاية ويجب على المرء مراقبة ذلك باستمرار. إذا تم التعبئة في باعث سحبها، ونحن لا تزال تقترح قياس backpressure العمود المتوقع لممتز معين في الاستخدام عن طريق التعبئة الشعيرات الدموية fritted أولا، ومن ثم لمعرفة ما إذا كان فريت الذاتي تجميع يضيف الكثير. بالنسبة لأية مشكلات ذات ضغط عال، استخدم الإرشادات الواردة في الجدول 1 لتحديد المشكلة.
في تجربتنا ، عمود معبأة دون تلون ، والثغرات ، ومع backpressure السليم يعمل في 100 ٪ من الحالات ويعطي نوعية الفصل قريبة من ما يمكن توقعه من طول العمود وخصائص ماصة. لا يضمن العمود الذي يحتوي على تلونات العمل بشكل صحيح ولكن لا يزال بإمكانه إعطاء نتائج مرضية.
معظم الوقت، إذا كان هناك أي مشاكل مع نوعية الفصل، فإنها لا تأتي من العمود نفسه، ولكن بدلا من أجزاء أخرى من نظام الفصل، وهي المضخات، المذيبات، أو الاتصالات. خاصة الضارة المحتملة هي أي اتصالات ما بعد العمود. يؤدي الاتصال السيئ بحجم ميت بين الباعث والعمود المفرخ إلى توسيع الذروة الرئيسية وتعقبها بسبب معدلات التدفق المنخفضة جدا في الكروماتوغرافيا الشعرية.
واحدة أكثر أهمية مسألة محددة لنهج FlashPack هو أنه يستخدم الكثير من المواد الماصة باهظة الثمن في قارورة الطين الممتزة العمل. يرجى تذكر أن الطين الماصة في FlashPack مخصص للاستخدام المتعدد. رعاية المواد الماصة. تجنب تحريك شريط المغناطيس غير الضروري للحد من طحن ماصة تذكر لوقف التناوب بمجرد الانتهاء من التعبئة. ولا تترك القارورة الماصة المفتوحة في قنبلة الضغط لتجنب التجفيف الماصة. على الرغم من أن المواد الماصة لا يزال يمكن استخدامها بعد ذلك، فإنه يأخذ بعض الوقت لإعادة تشكيل الطين ماصة.
الطريقة تعمل بشكل جيد على قدم المساواة لكل من الشعيرات الدموية fritted والشعيرات الدموية التي تنبعث منها. يزيد مبدأ FlashPack معدل التعبئة للم معرفات الشعرية من 20 إلى 250 ميكرومتر (لم يتم اختبار أصغر وأكبر). كما أنها تنطبق على جميع المواد الماصة، سواء بشكل كامل أو سطحي مسامية، يمكننا اختبار (مما يعكس أن تشكيل قبة ماصة في تركيز الطين الممتز عالية لا يقتصر على وجه التحديد على المواد الماصة RP). الى جانب ذلك، المعلمات المذيبات تؤثر بوضوح التعبئة وفقا لخصائصها الفيزيائية والكيميائية. على سبيل المثال، الأسيتون اللزج أقل يعطي معدل التعبئة أعلى من الميثانول في نفس ضغط التعبئة. ومع ذلك، فإنه هو أيضا أقل قطبية من الميثانول ويقلل من الجسيمات الماصة التمسك بعضها البعض. التأثير في حد ذاته يمنع تكوين قبة ماصة في بداية التعبئة عندما يكون معدل التدفق لا يزال مرتفعا. ومع ذلك ، فإن الحد من تفاعل الجسيمات الماصة يؤدي أيضا إلى تكوين فريت ذاتي التجميع أقل موثوقية وحظر أكثر تكرارا أثناء التعبئة. لذا ، في حين أن الأسيتون أفضل لتعبئة الشعيرات الدموية المفروقة ، إلا أنها أقل ملاءمة للشعيرات الدموية التي يتم سحبها ، مع الميثانول كمذيب ملاط أبطأ ولكنه مناسب لكلا النوعين من النهاية. التعبئة من الهيكسان أو ثنائي كلورو الميثان (DCM) هي الحالات القصوى للتحول إلى الأسيتون من الميثانول: فهي أقل قطبية ، لذلك تمنع تشكيل القبة الماصة تماما ، ومع ذلك فهي لا تصلح لتعبئة الانبعاثات المنسحبة على الإطلاق. الى جانب ذلك ، لوحظ أن القطبية DCM منخفضة للغاية يؤدي إلى جزيئات ماصة التمسك الجدار الشعرية الداخلية وجعل طبقة سميكة على ذلك. سمك طبقة ينمو تدريجيا وكتل محلية عشوائية شكل مما أدى إلى العمود معبأة في عدة أجزاء مفصولة مناطق دون ماصة. وقد لوحظ هذا التأثير لC18 الببتيد إيريس ماصة.
وثمة مسألة أخرى لوحظت وهي أن مادة YMC Triart C18 الماصة لا تعلق في الميثانول بشكل صحيح، بل تشكل نوعا من الرقائق. ومع ذلك ، فإن ذلك لا يمنعها من الحصول على معبأة مع FlashPack وإعطاء كفاءة فصل لائق جدا (بيانات غير منشورة). وهكذا، في حين لا يجري الأمثل لبعض الحالات، كان الميثانول المذيبات الأكثر عالمية للعمل لجميع المواد الماصة والأعمدة اختبارها. من الضروري أن نذكر أننا لم نحلل بعد كيف تؤثر مذيبات الطين المختلفة على كفاءة فصل العمود. وفي الوقت نفسه، فإن كفاءة الأعمدة المعبأة من الميثانول تساوي تماما الأعمدة التجارية لنفس المواد الماصة4.
FlashPack ليست الطريقة الوحيدة القائمة لتحسين معدل التعبئة من أعمدة UHPLC. التعبئة السريعة من تركيز الطين عالية ماصة ممكن أيضا مع استخدام الضغط العالي جدا التعبئة7. ميزة FlashPack هي أنها أبسط بكثير لأنها لا تتطلب مضخات ضغط عالية للغاية خاصة وقنابل ضغط لتوصيل المواد الماصة والاتصالات الشعرية. في الوقت نفسه ، ثبت أن الأعمدة المعبأة في ضغوط شديدة يمكن أن يكون لها كفاءة فصل أعلى من الأعمدة المعبأة تحت الضغط17. وعلى الرغم من أن FlashPack تنتج أعمدة مطابقة لتلك التجارية المستخدمة في المقارنة4، والتي لا نعرف طريقة التعبئة ، إلا أنها لم تختبر بعد كيف تقف أعمدة FlashPack ضد الأعمدة المعبأة ذات الضغط العالي للغاية.
باختصار ، يمكن تكييف طريقة FlashPack الموصوفة بسهولة مع بروتوكول التعبئة الموجود في المختبر مع بعض التعديلات التي أجريت على البروتوكول ، في حين يبقى الإعداد كما هو تماما. فإنه يسرع حزم العمود الشعرية HPLC إلى دقائق الوقت ويسمح إنتاج أعمدة الشعرية UHP طويلة، وهو أمر مستحيل بوضوح مع إجراء التعبئة القياسية. الاقتصاد العام في الوقت والمال للمختبر من خلال تطبيق نهج FlashPack يمكن عدها في عشرات الآلاف من اليورو سنويا. بالإضافة إلى ذلك، القدرة على إنتاج أعمدة الشعيرات الدموية UHP محليا يفتح إمكانيات التخصيص تجربة مستحيلة مع المنتجات التجارية المتاحة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم العمل من خلال منحة RSF 20-14-00121. يشكر المؤلفون ب. ف. شلياها (مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان) على المناقشات المثمرة.
Materials
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2×5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- . Pressure injection cells – next advance – laboratory instruments Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021)
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
