Обнаружение рецептор-связывающего домена антитела SARS-CoV-2 с помощью биорепортера на основе HiBiT
Summary
Описанный протокол описывает процедуру получения белкового комплекса HiBiT-рецептор-связывающего домена и его применение для быстрого и чувствительного обнаружения антител к SARS-CoV-2.
Abstract
Появление пандемии COVID-19 увеличило потребность в более совершенных серологических методах выявления для определения эпидемиологического воздействия тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2). Растущее число инфекций SARS-CoV-2 повышает потребность в лучших анализах обнаружения антител. Современные методы обнаружения антител ставят под угрозу чувствительность для скорости или являются чувствительными, но отнимают много времени. Большая часть SARS-CoV-2-нейтрализующих антител нацелена на рецептор-связывающий домен (RBD), один из первичных иммуногенных компартментов SARS-CoV-2. Недавно мы спроектировали и разработали высокочувствительный, биолюминесцентный RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) для обнаружения антител к SARS-CoV-2. В следующем тексте описывается процедура получения комплекса HiBiT-RBD и быстрый анализ для оценки наличия антител, нацеленных на RBD, с использованием этого инструмента. Благодаря долговечности белкового продукта HiBiT-RBD в широком диапазоне температур и более короткой экспериментальной процедуре, которая может быть завершена в течение 1 ч, протокол можно рассматривать как более эффективную альтернативу для обнаружения антител к SARS-CoV-2 в образцах сыворотки крови пациента.
Introduction
Недавнее появление нового коронавируса SARS-CoV21 вызвало более 2 800 000 смертельных случаев и 128 миллионов инфекций по состоянию на 30 марта 20212 года. Из-за отсутствия надежной и хорошо отлаженной процедуры лечения для клинической терапии SARS-CoV-2 было предпринято много усилий по ограничению дальнейшей передачи вируса и, что более важно, по разработке эффективного и надежного лечения или вакцины3. На сегодняшний день в испытаниях, о которых сообщила Всемирная организация здравоохранения4, насчитывается более 50 вакцин-кандидатов на вакцину от COVID-19. Выявление антител против SARS-CoV-2 имеет первостепенное значение для определения долгосрочной стабильности гуморального ответа при введении вакцины, а также у выздоровевших пациентов с COVID-195. Некоторые исследования показали, что существует вероятность того, что выздоровевшие пациенты с SARS-CoV-2 теряют большую часть RBD-связывающих антител через 1 год5,6,7,8,9. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять устойчивый иммунитет, и более чувствительные платформы обнаружения антител могут помочь в дальнейшей такой работе. Сообщения о устойчивом иммунитете к легким инфекциям SARS-CoV-2, которые предполагают долгосрочные реакции антител, также являются интересной и стоящей областью исследования. Быстрый и точный метод обнаружения необходим для мониторинга антител в сыворотках людей, чтобы предоставить больше информации об иммунитете в популяции.
Как и другие коронавирусы, SARS-CoV-2 использует выступающий шип гликопротеин для связывания с ангиотензинпревращающим ферментом-2 (ACE2), чтобы инициировать каскад событий, которые приводят к слиянию вирусной и клеточной мембран6,7. Несколько исследований недавно доказали, что RBD белка Spike играет решающую роль в получении мощного и специфического ответа антител против SARS-CoV28,9,10,11. В частности, корреляции, наблюдаемые Premkumar et al. между титром RBD-связывающего антитела и эффективностью нейтрализации SARS-CoV-2 плазмы пациентов, согласуются с тем, что RBD является иммуногенным компартментом структуры вируса9. Имея это в виду, многие диагностические тесты, доступные для обнаружения антител к SARS-CoV-2, являются трудоемкими и дорогостоящими, требуют длительной процедуры инкубации и промывки (иммуноферментный анализ [ИФА]) или отсутствия чувствительности и точности (иммуноанализ бокового потока [LFIA])12. Таким образом, количественный и быстрый комплементарный серологический метод обнаружения антител, полученных из COVID-19, с высокой чувствительностью, быстрым ответом и относительно низкой стоимостью, послужил бы необходимости в надежном серологическом тесте для эпидемиологического эпиднадзора SARS-CoV-2.
В совокупности ограничения текущих серологических анализов побудили к исследованию системы биолюминесцентной отчетности в качестве потенциального диагностического агента в будущих серообследовании. Биолюминесценция представляет собой естественную реакцию фермента / субстрата с излучением света. Нанолюк люцифераза является самой маленькой (19 кДа), но самой яркой системой по сравнению с Люциферазой Рениллы и светлячка (36 кДа и 61 кДа соответственно)13,14. Кроме того, Nanoluc имеет самое высокое отношение сигнал/шум и стабильность среди ранее упомянутых систем. Высокая интенсивность сигнала Nanoluc поддерживает обнаружение даже очень низких количеств репортерных слияний15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) представляет собой разделенную версию системы Nanoluc, которая состоит из двух сегментов: малого BiT (11 аминокислот; SmBiT) и большой BiT (LgBiT) с относительно низкими аффинными взаимодействиями (KD = 190 мкМ) с образованием люминесцентного комплекса16. NanoBiT широко используется в различных исследованиях, включающих идентификацию белково-белковых взаимодействий15,17,18,19 и клеточных сигнальных путей11,20,21.
Недавно вместо SmBiT был введен еще один небольшой пептид с явно более высоким сродством к LgBiT (KD = 0,7 нМ), а именно система HiBiT Nano-Glo. Высокое сродство и сильный сигнал анализа Nano-Glo «add-mix-read» делает HiBiT подходящей, количественной, люминесцентной пептидной меткой. В этом подходе тег HiBiT добавляется к белку-мишени путем разработки конструкции, накладывающей минимальные структурные помехи. Слияние HiBiT-белка будет активно связываться с аналогом LgBiT, производя высокоактивный фермент люциферазы для генерации обнаруживаемой биолюминесценции в присутствии реагентов обнаружения (рисунок 1). Аналогичным образом, мы разработали систему на основе HiBiT Nano-Glo для легкого измерения титра нейтрализующих антител в сыворотках выздоровевших людей SARS-CoV-2 и недавно разработали HIBiT-помеченный SARS-CoV-2 RBD. В этой статье описывается протокол производства биорепортера HiBiT-RBD с использованием стандартных лабораторных процедур и оборудования, и показано, как этот биорепортер может быть использован в быстром и эффективном анализе для обнаружения антител, нацеленных на SARS-CoV-2 RBD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Растущее число людей, инфицированных SARS-CoV-2, и продолжающиеся усилия по глобальной вакцинации требуют чувствительных и быстрых серологических тестов, которые могут быть использованы в крупномасштабных серообследовании. Недавние исследования показывают, что биорепортеры на основе ра…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы ценим и благодарим за техническую помощь Сяохун Хэ, Рикардо Мариуса, Джулии Петрик, Брэдли Остина и Кристиано Танезе Де Соуза. Мы также благодарим Мину Гахремани за графический дизайн. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования. DWC частично поддерживается факультетом uOttawa и кафедрой медицины.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
