마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석
Summary
여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
크로마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)은 전사 인자(TF), 크로마티안 레귤레이터 및 히스톤 수정의 전체 게놈 위치를 매핑하고 TF 결합 패턴 및 그의 톤 후번역 변형을 밝히기 위한 전체 게놈을 검출하기 위한 강력하고 널리 사용되는 분자 기술입니다. 히스톤 메틸화와 같은 크로마틴 수정 활동은 종종 특정 유전자 조절 서열에 채용되어 크로마틴 구조의 국소적 변화를 일으키고 특정 전사 효과를 초래합니다. 쌀 폭발은 전 세계적으로 쌀에 치명적인 곰팡이 질병이며 곰팡이 식물 상호 작용을 연구하기위한 모델 시스템입니다. 그러나, 히스톤 수정이 Magnaporthe oryzae에 있는 그들의 독성 유전자를 통제하는 방법에 있는 분자 기계장치는 애매하게 남아 있습니다. 더 많은 연구원은 그의 음색 후생유전학 수정이 그들의 표적 유전자를 통제하는 방법을 연구하기 위하여 ChIP-seq를 이용할 필요가 있습니다. ChIP-seq는 또한 동물과 식물에 있는 단백질과 DNA 사이 상호 작용을 연구하기 위하여 널리 이용됩니다, 그러나 식물 병리학의 분야에서 적게 이용되고 잘 개발되지 않았습니다. 본 논문에서는, M. oryzae에서 기능적 표적 유전자에 결합하는 히스톤 메틸화(예: H3K4me3)의 게놈 전체 분포를 확인하기 위해 ChIP-seq의 실험 과정 및 작동 방법을 설명한다. 여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.
Introduction
후성 유전학은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변경하지 않고 유전자 발현의 유전적 변화를 지칭하는 유전 연구의 한 가지이다. 후생유전학적 조절이 고차구조로접기 및 조립의 동적 과정을 통해 유전자 발현을 조절하고 영향을 미치는 크로마티닌을 포함한 진핵세포의 성장과 발달에 중요한 역할을 한다는 것을보여주었다. 크로마틴 리모델링 및 공유 히스톤 수정은 크로마틴 폴리머의 변이를 통해 크로마틴의 기능 및 구조를 조절하여 유전자 발현3,4,5,6을조절하는 기능을 달성한다. 히스톤의 번역 후 변형은 아세틸화, 인산화, 메틸화, 일축비퀴티니션, 스모틸화 및 ADP 리보실레이션7,8,9를포함한다. 히스톤 H3K4 메틸화, 특히 트리메틸화는, 진핵생물10,11에서전사 복제, 재조합, 수리 및 RNA 처리와 관련된 전사 시작 부위에 매핑되었다.
ChIP-seq 기술은 2007년에 도입되었으며, 전사 조절 및 후성유전학기전(12,13)의게놈 전체 분석을 위한 실험 표준이 되었다. 이 방법은 게놈 전체 규모와 DNA 결합 단백질의 DNA 세그먼트를 포함하는 히스톤 또는 전사 인자 상호 작용 정보를 얻기에 적합합니다. 관심 있는 단백질에 교차된 모든 DNA 순서는 크로마틴 복합체의 일부로 coprecipitate 것입니다. 차세대 염기서열 분석 기술은 또한 36-100 bp의 DNA를 서열화하는 데 사용되며, 이는 해당 표적 게놈과 일치한다.
식물성 균류에서, 연구는 최근에 히스톤 메틸화 수정이 병원성 과정에서 그들의 표적 유전자를 통제하는 방법을 연구하기 시작했습니다. 몇몇 이전 연구 결과는 히스톤 메틸라제 관련 유전자의 규정이 주로 유전자 침묵과 이차 대사 산물 (SM)의 생산을 촉매에 반영한다는 것을 증명했습니다. MoSet1은 M. 오리자에 있는 H3K4 메틸라제입니다. 이 유전자의 녹아웃은 H3K4me3 수정14의완전한 삭제를 초래한다. 야생형 균주와 비교하여, 돌연변이체내의 MoCEL7C 유전자의 발현은 CMC 유도 상태 및 비유도 상태(포도당 또는 셀로바이오세)에서 억제되며, MoCEL7C의 발현은15증가하였다. 후사리움 에서,KMT6는 H3K27me3의 메틸화 변형을 촉매하고, 곰팡이의 정상적인 발달을 조절하고, SM 유전자클러스터(16, 17,18,19)를포함하는 “비밀게놈”을 조절하는 데 도움을 줄 수 있다. 2013년, 코놀리는 H3K9와 H3K27 메틸화가 표적유전자(20)의억제를 조절하는 이차 대사산물 및 이펙터 인자를 통해 곰팡이의 병원성 과정을 조절한다고 보고했다. 아스퍼길러스에서는,히스톤 H3K4me2 및 H3K4me3의 변형은 유전자 활성화와 관련이 있으며 SM 유전자클러스터(21)의크로마틴 수준 조절을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. M. oryzae에서,Tig1 (효모및 포유동물의 티그1에 동종)은 HADC (히스톤 디스티틸라제)22이다. Tig1 유전자의 녹아웃은 null 돌연변이체에서 병원성과 포자 생산 능력의 완전한 손실로 이어집니다. 감염성최해(22)를생성할 수 없는 peroxygen 환경에 더 민감하다.
M. oryzae.에 의한 쌀 폭발은 세계에서 가장 큰 쌀 재배 지역에서 가장 심각한 쌀 질환 중 하나입니다19. 그것의 대표적인 감염 과정 때문에, M. oryzae는 많은 중요한 병원성 균류의 감염 과정과 유사합니다. 분자 유전 적 작업을 쉽게 수행 할 수 있기 때문에 곰팡이식물 상호 작용(23)을연구하기위한 모델 유기체가되었습니다. M. oryzae의 감염 과정의 모든 단계를 차단하면 감염이 실패 할 수 있습니다. 감염 과정 동안 형태학적 변화는 전체 게놈 기능 및 유전자 전사에 의해 엄격하게 조절된다. 그 중에서도 히스톤 메틸화와 같은 후성유전학적 변형은 기능성유전자(24,25)의전사 조절에 필수적인 역할을 한다. 그러나, 지금까지, M. oryzae에 있는 병인 유전자의 전사에 있는 히스톤 메틸화 및 히스톤 아세틸화와 같은 후성 유전학 적 변형의 분자 기계장치에 몇몇 연구 결과가 행해졌습니다. 따라서, 이러한 병원성 관련 유전자의 상류 및 하류 규제 네트워크를 연구하면서 쌀 폭발 곰팡이의 후성유전학 적 조절 메커니즘을 더욱 개발하는 것은 쌀 폭발 예방 및 제어 전략을 개발하는 데 도움이 될 것이다.
ChIP-seq와 같은 기능성 유전체학의 발달, 특히 후성 유전학에서, 이 높은 처리량 데이터 수집 방법은 염색체에 대한 연구를 가속화했습니다. ChIP-seq 실험 기술을 사용하여, M. oryzae 및 기타 필라멘트 균류에서 히스톤 메틸레이션(예: H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3)의 게놈 전체 분포를 식별할 수 있다. 따라서,이 방법은 후성 유전학 수정이 식물 병리학에서 곰팡이 병인 동안 후보 대상 유전자를 조절하는 방법 의 밑에 분자 메커니즘을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근에는 ChIP-seq가 특정 히스톤에 의해 변형된 TF 또는 농축 부위의 결합 부위를 결정하는 데 널리 사용되는 게놈 분석 방법이 되고 있다. 이전 ChIP-seq 기술과 비교하여 새로운 ChIP-seq 기술은 매우 민감하고 유연합니다. 결과는 핵산의 비특이적 혼성화에 의한 잡음 신호와 같은 부정적인 영향 없이 고해상도로 제공된다. 이것은 일반적인 유전자 발현 분석이지만, 많은 계산 방법이 검증되었으며, 소?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31871638 보조금 제1호), 베이징농업대학교 특별과학연구프로젝트(YQ201603), 베이징교육위원회 과학프로젝트(KM201610020005), BUA(GJB2021005)의 고도과학연구육성사업으로 지원되었다.
Materials
| acidic casein hydrolysate | WAKO | 65072-00-6 | Medium configuration |
| agar powder | scientan | 9002-18-0 | Medium configuration |
| deoxycholic acid | MedChemExpress | 83-44-3 | protein and dissolution |
| DNA End-Repair kit | NovoBiotec | ER81050 | Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing |
| Dynabeads | Invitrogen | no.100.02D | Binding target |
| EB buffer | JIMEI | JC2174 | Membrane and liquid |
| EDTA | ThermoFisher | AM9912 | protease inhibitor |
| enzymatic casein hydrolysate | Sigma | 91079-40-2 | Medium configuration |
| glucose | Sigma | 50-99-7 | Medium configuration |
| glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Precipitant action |
| H3K4me3 antibodies | Abcam | ab8580 | Immune response to H3K4me3 protein |
| illumina Genome Analyzer | illumina | illumina Hiseq 2000 | Large configuration |
| Illumina PCR primers | illumina | CleanPlex | Random universal primer |
| isoamyl alcohol | chemical book | 30899-19-5 | Purified DNA |
| LiCl | ThermoFisher | AM9480 | specific removal RNA |
| lysing enzymes | Sigma | L1412-10G | cell lysis buffer |
| Mouse IgG | Yeasen | 36111ES10 | Animal normal immunoglobulin |
| NaCl solution | ThermoFisher | 7647-14-5 | Medium configuration |
| NaHCO3 | Seebio | SH30173.08* | preparation of protein complex eluent |
| NP-40 | ThermoFisher | 85124 | cell lysate to promote cell lysis |
| PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | The purification procedure removes primers from DNA samples |
| protease inhibitors | ThermoFisher | A32965 | A protein inhibitor that decreases protein activity |
| Proteinase K | ThermoFisher | AM2546 | DNA Extraction Reagent |
| Qubit 4.0 | ThermoFisher | Q33226 | Medium configuration |
| RIPA buffer | ThermoFisher | 9806S | cell lysis buffer |
| RNase A | ThermoFisher | AM2271 | Purified DNA |
| SDS | ThermoFisher | AM9820 | cover up the charge differences |
| sodium acetate solution | ThermoFisher | R1181 | Acetic acid buffer |
| sodium deoxycholate | ThermoFisher | 89904 | inhibition of protease degradation |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher | EL0011 | Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase |
| T4 DNA ligase buffer | ThermoFisher | B69 | DNA ligase buffer |
| Tris-HCl | ThermoFisher | 1185-53-1 | buffer action |
| Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | keep the membrane protein stable |
| yeast extract | OXOID | LP0021 | Medium configuration |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- Luger, K., et al. Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Strathl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation. Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).
- Bhaumik, S. R., et al. Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).
- Shilatifard, A. Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation. Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).
- Bernstein, B. E., et al. The mammalian epigenome. Cell. 128 (4), 669-681 (2007).
- Weake, V. M., Workman, J. L. Histone ubiquitination: triggering gene activity. Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).
- Workman, J. L., Kingston, R. E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach. Bio-protocol. 10 (4), 3520 (2020).
- Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis. Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).
- Kieu, T., et al. MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis. Plos Genetics. 11 (7), 11005385 (2015).
- Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).
- Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).
- Wang, G. H., et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum. PLoS One. 7 (5), 38324 (2012).
- Liu, Y., et al. Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum. Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).
- Zhang, M. Y., et al. The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters. PloS Genetics. 9 (10), 1003916 (2013).
- Palmer, J. M., et al. Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus. PeerJ. 1, 4 (2013).
- Ding, S. L., et al. The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Allis, C. D., et al. New nomenclature for chromatin-modifying enzymes. Cell. 131 (4), 633-636 (2007).
- Shilatifard, A. The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis. Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).
- Zhou, S. D., et al. The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).
