Summary

Análisis de todo el genoma de la distribución de modificaciones de histonas utilizando el método de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en Magnaporthe oryzae

Published: June 02, 2021
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.

Abstract

La secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-seq) es una técnica molecular poderosa y ampliamente utilizada para mapear las ubicaciones del genoma completo de los factores de transcripción (TF), los reguladores de cromatina y las modificaciones de histonas, así como para detectar genomas completos para descubrir patrones de unión a TF y modificaciones posttraduccionales de histonas. Las actividades modificadoras de la cromatina, como la metilación de histonas, a menudo se reclutan para secuencias reguladoras de genes específicas, causando cambios localizados en las estructuras de la cromatina y dando lugar a efectos transcripcionales específicos. La explosión del arroz es una enfermedad fúngica devastadora en el arroz en todo el mundo y es un sistema modelo para estudiar la interacción hongo-planta. Sin embargo, los mecanismos moleculares en la forma en que las modificaciones de histonas regulan sus genes de virulencia en Magnaporthe oryzae siguen siendo esquivos. Más investigadores necesitan usar ChIP-seq para estudiar cómo la modificación epigenética de histonas regula sus genes objetivo. ChIP-seq también se utiliza ampliamente para estudiar la interacción entre la proteína y el ADN en animales y plantas, pero es menos utilizado en el campo de la fitopatología y no ha sido bien desarrollado. En este artículo, describimos el proceso experimental y el método de operación de ChIP-seq para identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3) que se une a los genes diana funcionales en M. oryzae. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.

Introduction

La epigenética es una rama de la investigación genética que se refiere al cambio heredable de la expresión génica sin cambiar la secuencia de nucleótidos de los genes. Un número creciente de estudios han demostrado que la regulación epigenética juega un papel importante en el crecimiento y desarrollo de las células eucariotas, incluida la cromatina que regula y afecta la expresión génica a través del proceso dinámico de plegamiento y ensamblaje en estructuras de orden superior1,2. La remodelación de la cromatina y la modificación de las histonas covalentes afectan y regulan la función y estructura de la cromatina a través de la variación de los polímeros de cromatina, logrando así la función de regular la expresióngénica 3,4,5,6. Las modificaciones posttraduccionales de la histona incluyen acetilación, fosforilación, metilación, monoubiquitinación, sumoilación y ribosilación ADP7,8,9. La metilación de la histona H3K4, particularmente la trimetilación, se ha mapeado a los sitios de inicio de la transcripción donde se asocia con la replicación de la transcripción, la recombinación, la reparación y el procesamiento de ARN en eucariotas10,11.

La tecnología ChIP-seq se introdujo en 2007 y se ha convertido en el estándar experimental para el análisis de todo el genoma de la regulación transcripcional y los mecanismos epigenéticos12,13. Este método es adecuado a escala de todo el genoma y para obtener información de interacción de histonas o factores de transcripción, incluidos los segmentos de ADN de las proteínas de unión al ADN. Cualquier secuencia de ADN entrecruzada a proteínas de interés coprecipitará como parte del complejo de cromatina. Las técnicas de secuenciación de nueva generación también se utilizan para secuenciar 36-100 pb de ADN, que luego se emparejan con el genoma objetivo correspondiente.

En hongos fitopatógenos, la investigación ha comenzado recientemente a estudiar cómo las modificaciones de metilación de histonas regulan sus genes diana en el proceso de patogenicidad. Algunos estudios previos demostraron que la regulación de los genes relacionados con la histona metilasa se refleja principalmente en el silenciamiento génico y la catalización de la producción de metabolitos secundarios (SM). MoSet1 es la H3K4 metilasa en M. oryzae. La eliminación de este gen da como resultado la eliminación completa de la modificación H3K4me314. En comparación con la cepa de tipo salvaje, la expresión del gen MoCEL7C en el mutante se inhibe en el estado inducido por CMC y en el estado no inducido (glucosa o celobiosa), la expresión de MoCEL7C aumentó15. En Fusarium graminearum,KMT6 puede catalizar la modificación de la metilación de H3K27me3, regular el desarrollo normal de hongos y ayudar a regular el “genoma críptico” que contiene el grupo de genes SM16,17,18,19. En 2013, Connolly informó que la metilación de H3K9 y H3K27 regula el proceso patogénico de los hongos a través de metabolitos secundarios y factores efectores que regulan la inhibición de los genes diana20. En Aspergillus,la modificación de las histonas H3K4me2 y H3K4me3 está relacionada con la activación génica y juega un papel importante en el control de la regulación del nivel de cromatina de los grupos de genes SM21. En M. oryzae,Tig1 (homólogo a Tig1 en levaduras y mamíferos) es un HADC (histona desacetilasa)22. La eliminación del gen Tig1 conduce a la pérdida completa de la patogenicidad y la capacidad de producción de esporas en el mutante nulo. Es más sensible a un ambiente de peroxígeno, que no puede producir hifas infecciosas22.

La explosión de arroz causada por M. oryzae. es una de las enfermedades más graves del arroz en la mayoría de las zonas de cultivo de arroz en el mundo19. Debido a su proceso de infección representativo, M. oryzae es similar al proceso de infección de muchos hongos patógenos importantes. Como puede llevar a cabo fácilmente operaciones genéticas moleculares, el hongo se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de las interacciones fúngico-planta23. El bloqueo de cada paso del proceso de infección de M. oryzae puede resultar en una infección fallida. Los cambios morfológicos durante el proceso de infección están estrictamente regulados por la función completa del genoma y la transcripción de genes. Entre ellas, las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas juegan un papel esencial en la regulación transcripcional de los genes funcionales24,25. Sin embargo, hasta ahora, se han realizado pocos estudios sobre el mecanismo molecular de las modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y la acetilación de histonas en la transcripción de genes de patogénesis en M. oryzae. Por lo tanto, desarrollar aún más el mecanismo de regulación epigenética del hongo de la explosión de arroz mientras se investiga en la red reguladora aguas arriba y aguas abajo de estos genes patógenos relacionados ayudará a desarrollar estrategias de prevención y control de la explosión de arroz.

Con el desarrollo de la genómica funcional como ChIP-seq, especialmente en epigenética, este método de adquisición de datos de alto rendimiento ha acelerado la investigación sobre los cromosomas. Utilizando la tecnología experimental ChIP-seq, se puede identificar la distribución de todo el genoma de la metilación de histonas (como H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) en M. oryzae y otros hongos filamentosos. Por lo tanto, este método puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a cómo las modificaciones epigenéticas regulan sus genes diana candidatos durante la patogénesis fúngica en la patología vegetal.

Protocol

1. Preparación de protoplastos de M. oryzae Preparar el agar avena-tomate (OTA). Pesar 30-50 g de avena y hervirla en 800 mL de agua (ddH2O) durante 20 min. Filtre a través de dos capas de gasa y tome el filtrado. Recoge los tomates maduros y pélalos. Exprima el jugo y filtre a través de dos capas de gasa para recolectar 150 ml del jugo filtrado. Mezclar bien todo el zumo de tomate y el filtrado de avena preparado y añadir ddH2O hasta 1000 mL.</l…

Representative Results

Todo el diagrama de flujo del método ChIP-seq se muestra en la Figura 1. Los experimentos ChIP-seq se realizaron utilizando anticuerpos contra H3K4me3 en la cepa de tipo salvaje P131 y tres cepas mutantes nulas que carecían del gen mobre2, mospp1y moswd2 para verificar el perfil completo del genoma completo de la distribución de la histona H3K4me3 en M. oryzae. Los protoplastos de la cepa de tipo salvaje, Δmobre2, Δmospp1y Δmosw…

Discussion

Recientemente, ChIP-seq se ha convertido en un método de análisis genómico ampliamente utilizado para determinar los sitios de unión de TFs o sitios de enriquecimiento modificados por histonas específicas. En comparación con la tecnología ChIP-seq anterior, la nueva tecnología ChIP-seq es altamente sensible y flexible. Los resultados se proporcionan en alta resolución sin efectos negativos, como la señal de ruido causada por la hibridación inespecífico de ácidos nucleicos. Aunque este es un análisis de expr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención no. 31871638), el Proyecto Especial de Investigación Científica de la Universidad de Agricultura de Beijing (YQ201603), el Proyecto Científico del Comité Educativo de Beijing (KM201610020005), el proyecto de cultivo de investigación científica de alto nivel de BUA (GJB2021005).

Materials

acidic casein hydrolysate WAKO 65072-00-6 Medium configuration
agar powder scientan 9002-18-0 Medium configuration
deoxycholic acid MedChemExpress 83-44-3 protein and dissolution
DNA End-Repair kit NovoBiotec ER81050 Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads Invitrogen no.100.02D Binding target
EB buffer JIMEI JC2174 Membrane and liquid
EDTA ThermoFisher AM9912 protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate Sigma 91079-40-2 Medium configuration
glucose Sigma 50-99-7 Medium configuration
glycogen ThermoFisher AM9510 Precipitant action
H3K4me3 antibodies Abcam ab8580 Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer illumina illumina Hiseq 2000 Large configuration
Illumina PCR primers illumina CleanPlex Random universal primer
isoamyl alcohol chemical book 30899-19-5 Purified DNA
LiCl ThermoFisher AM9480 specific removal RNA
lysing enzymes Sigma L1412-10G cell lysis buffer
Mouse IgG Yeasen 36111ES10 Animal normal immunoglobulin
NaCl solution ThermoFisher 7647-14-5 Medium configuration
NaHCO3 Seebio SH30173.08* preparation of protein complex eluent
NP-40 ThermoFisher 85124 cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit Qiagen 28004 The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors ThermoFisher A32965 A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K ThermoFisher AM2546 DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0 ThermoFisher Q33226 Medium configuration
RIPA buffer ThermoFisher 9806S cell lysis buffer
RNase A ThermoFisher AM2271 Purified DNA
SDS ThermoFisher AM9820 cover up the charge differences
sodium acetate solution ThermoFisher R1181 Acetic acid buffer
sodium deoxycholate ThermoFisher 89904 inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase ThermoFisher EL0011 Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer ThermoFisher B69 DNA ligase buffer
Tris-HCl ThermoFisher 1185-53-1 buffer action
Triton X-100 ThermoFisher HFH10 keep the membrane protein stable
yeast extract OXOID LP0021 Medium configuration

References

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Cite This Article
Wu, Z., Sun, W., Zhou, S., Zhang, L., Zhao, X., Xu, Y., Wang, W. Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae. J. Vis. Exp. (172), e62423, doi:10.3791/62423 (2021).

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