Doku ve İdrardan İnsan Böbrek Tubuloidlerinin Üretimi

NOT: Burada açıklanan deneyler Erasmus Tıp Merkezi (Rotterdam, Hollanda) ve Prenses Máxima Pediatrik Onkoloji Merkezi (Utrecht, Hollanda) tıbbi etik komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Dokudan insan böbrek tübuloidlerinin üretimi Malzeme 37 °C’de bir gecede prewarm multiwell doku kültürü plakaları (6, 12 ve 24 kuyular). Gelişmiş DMEM/F12’ye 1x L-alanin/L-glutamin takviyesi, %1 w/v 4-(2-hidroksetil)-1-piperazine etanesülfik asit (HEPES, 10 mM) ve %1 Penisilin/Streptomisin antibiyotikleri ekleyerek bazal ortam (AdDF+++) hazırlayın. %1,5 B27 takviyesi, R-spondin şartlandırılmış ortam ekleyerek kültür ortamı hazırlamak, epidermal büyüme faktörü (50 ng/mL), fibroblast büyüme faktörü-10 (100 ng/mL), N-asetilsistein (1,25 mM), Rho-kinas Y-27632 (10 μM), geniş spektrumlu antibiyotikler (0,1 mg/mL) ve AdDF+++’a A83-01 (5 μM) inhibitörü. Kullanmadan önce 37 °C’ye kadar ısıtın. Bir aliquot’ı 4 °C’de bir gecede eriterek bodrum membran ekstresini (BME) hazırlayın. İşlem sırasında BME’yi buzda tutun. Kollajenaz çözeltisini, 10 μM Y-27632 ilavesiyle AdDF+++’ta 1 mg/mL’lik son konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. 37 °C’ye kadar ısıtın. 10 cm Petri yemekleri, neşterler ve cımbız hazırlayın. 20 dakika boyunca ultraviyole lamba uygulayarak mutfak eşyaları dezenfekte edin, ardından dezenfektan, demi suyu ve% 70 v / v etanol ile yıkayın. Mutfak eşyaları havadan kurulayın. 37 °C’ye kadar yatay bir çalkalayıcıyı önceden ısıtın. Prosedür Böbrek dokusunu 30-40 mL AdDF+++ ortamı ile dolu 50 mL’lik bir tüpte toplayın. Doku parçasını 10 cm’lik bir Petri kabına ~1 mL orta olarak yerleştirin. Neşter kullanarak dokuyu ~1 mm3 boyutlu parçalar halinde kıyma yapın (Şekil 1A). Kıyılmış dokuyu neşter ve neşter kullanarak 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Petri kabına 5 mL AdDF+++ ekleyin, 10 mL steril pipetle ortamı yıkayın ve toplayın. Tüm bu içerikleri aynı tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj ve üst yapıyı çıkarın. 15 mL tüpe 3-4 mL kollajenaz çözeltisi ekleyin. Tüpü 37 °C’de ayarlanmış yatay bir çalkalayıcıya ve 250 rpm hıza taşıyın. kuluçkanın ilk 15 dakikasının ardından, numuneyi kontrol edin ve tüpü kuvvetlice sallayın. Süspansiyon homojen olana ve çoğu doku parçası kaybolana kadar, maksimum kuluçka süresi 45-60 dk olana kadar tekrarlayın. Tüpü AdDF+++ ile doldurun ve tüpü 5-10x ters çevirerek karıştırın. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Pelet kırmızıysa, 1.2.6 adımına geçin. Aksi takdirde, 1.2.8 adımına gidin. Hücre peletinin üzerine 1 mL kırmızı kan hücresi liziz tamponu ekleyin (Malzeme Tablosunabakın). Peleti yeniden çıkarmak için tüpe hafifçe dokunun (pipet ucuyla yeniden harcamayın). Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır. Tüpü AdDF+++ ile doldurun. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Kan hücreleri hala görünür durumdaysa, 1.2.6 adımından başlayarak prosedürü bir kez daha tekrarlayın. Aksi takdirde, 1.2.8 adımına geçin. Protokolün bu noktasında doku parçaları görünüyorsa, 1.2.8 adımına geçin. Aksi takdirde, 1.2.9 adımında pelet hacminin ölçümüne devam edin. Tüpe 5 mL AdDF+++ ekleyin ve 10 mL steril pipetle yeniden ıslatın. Süspansiyonu 50 mL’lik bir tüpe yerleştirilen 100 μm naylon hücre süzgecinden filtreleyin. Filtrelenmiş süspansiyonu yeni bir 15 mL tüpe aktarın. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Bilinen bir birime ayarlanmış bir p1000 pipet kullanarak hücre peletinin hacmini ölçün. Hava kabarcıkları oluşturmadan yeniden dirimek için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Tüpü 1 dakika boyunca buza aktarın. Pelete% 70-75 hacim bme ekleyin. P1000 veya p200 pipet kullanarak yeniden biriktirin, ve plaka 15 μL damlacıklar önceden ısıtılmış, çok amaçlı hücre kültür plakasında (6, 12 veya 24 kuyular), toplam kaplama hacmine göre (200 μL, 6 kuyu)). Plakayı ters çevirin ve plakayı 37 °C’de 15-20 dakika inkübatördedinlendirin (Şekil 1C). Önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin ve kültürleri inceleyin (Şekil 1C,D). 2. İdrardan insan böbrek tübuloidlerinin üretimi NOT: İdrar hücreler için düşmanca bir ortamdır. İdrar örneklerinin mümkün olan en kısa sürede, tercihen atılımdan itibaren 4 saat içinde işlenmesi bu protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesi için önemlidir. Bu arada idrar örnekleri 4 °C’de saklanmalıdır. Malzeme 37 °C’de bir gecede prewarm multiwell doku kültürü plakaları (6, 12 ve 24 kuyular). Yıkama ortamını hazırlayın: Geniş spektrumlu antibiyotiklerle (0,1 mg/mL) ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş AdDF+++. Yukarıda açıklandığı gibi kültür ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce 37 °C’de ısınan. BME matrisini hazırlayın. İşlem sırasında buzda tutun. Prosedür Bir idrar örneği toplayın ve eşit olarak 50 mL tüplere bölün (Şekil 2A-I). Tüplerin her birine 10-20 mL yıkama ortamı ekleyin. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj(Şekil 2A-II)ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Tüplerin her birine 10 mL yıkama ortamı ekleyin. Peletleri 10 mL steril pipet kullanarak dikkatlice yeniden dirildi. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüj(Şekil 2A-III)ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Peletleri yeniden haline alın ve tüm tüplerin içeriğini tek bir 15 mL tüpe aktarın. Tüpü yıkama ortamı ile doldurun. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüj(Şekil 2A-IV)ve süpernatantı çıkarın. Bilinen bir birime ayarlanmış bir p1000 pipet kullanarak hücre peletinin hacmini ölçün. Hava kabarcıkları oluşturmadan yeniden dirimek için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Tüpü 1 dakika boyunca buza aktarın. Pelete% 70-75 bme hacmi ekleyin. P1000 veya p200 pipet kullanarak yeniden biriktirin, ve plaka 15 μL damlacıklar önceden ısıtılmış, çok amaçlı hücre kültür plakasında (6, 12 veya 24 kuyular), toplam kaplama hacmine göre (200 μL, 6 kuyu)). 37 °C’de 15-20 dakika boyunca inkübatörde plakaları ters çevirin. Önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin ve kültürleri inceleyin (Şekil 2B). 3. Tübuloid kültürlerinin genişlemesi NOT: Tubuloid kültürleri yaklaşık 1-2 haftada bir 1:2-1:3 bölünme oranı ile geçiş yapılabilir. Genellikle çizgiye özgü varyasyonlarla yaklaşık 15 pasaj için genişletilebilirler. Malzeme 37 °C’de bir gecede prewarm multiwell doku kültürü plakaları (6, 12 ve 24 kuyular). Bazal ortam (AdDF+++) hazırlayın ve işlem sırasında buzda tutun. Daha önce açıklandığı gibi kültür ortamı hazırlayın. Kullanmadan önce 37 °C’ye kadar ısıtın. BME matrisini hazırlayın ve işlem sırasında buzda tutun. 10 μM konsantrasyona Y-27632 ilavesi ile tripsin değiştirme maddesi hazırlayın. Filtrelenmemiş p10 uçlarını otomatik olarak örtün. Santrifüjü 4 °C’ye soğutun. Prosedür Kuyuda bulunan ortamı kullanarak bir p1000 pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme yaparak tubuloidleri içeren damlacıkları bozun. Ucu, kuyunun altını kazımak için kullanın, tabana bağlı tüm hücreleri topladığından emin olun. İçeriği 15 mL’lik bir tüpte toplayın. 10 mL AdDF+++ ekleyin. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Peletin boyutuna bağlı olarak, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş tripsin yedek maddesi ekleyin. Tubuloid içeren 200 μL BME damlacıkları için 1 mL tripsin replasman maddesi kullanın. 5 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yaslanın. Uçlu bir p1000 pipet kullanın ve 1000 μL ucun üzerine filtrelenmemiş, steril bir p10 ucu yerleştirin. Pipet, organoidleri mekanik olarak bozmak için 20-30x boyunca yukarı ve aşağı. Tüpte hala çok sayıda sağlam organoid olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin (Şekil 3A). Bu noktada sağlam organoidlerin% 10’undan fazlası mevcutsa, 3.2.3 adımındaki 5 dakikalık inkübasyondan, 3.2.5 adımdaki bozulmamış organoidler için mikroskobik gözleme bir kez daha tekrarlayın. Aksi takdirde, adım 3.2.6 ile devam edin. Tüpü AdDF+++ ile doldurun. 4 °C’de 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Bilinen bir birime ayarlanmış bir p1000 pipet kullanarak hücre peletinin hacmini ölçün. Hava kabarcıkları oluşturmadan yeniden dirimek için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Tüpü 1 dakika boyunca buza aktarın. Pelete% 70-75 hacim bme ekleyin. P1000 veya p200 pipet kullanarak yeniden biriktirin, ve plaka 15 μL damlacıklar önceden ısıtılmış, çok amaçlı hücre kültür plakasında (6, 12 veya 24 kuyular), toplam kaplama hacmine göre (200 μL, 6 kuyu)). Plakaları ters çevirin ve plakayı 37 °C’de 15-20 dakika boyunca inkübatörde dinlendirin. Önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin ve kültürleri inceleyin (Şekil 3B).