गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण, शुद्धिकरण और प्रोफाइलिंग
Summary
गैंग्लियोसाइड्स सियालिक एसिड-असर वाले ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स हैं जो मस्तिष्क में विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में होते हैं। उनकी एम्फीपैथिक प्रकृति को इष्टतम वसूली और सटीक विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए कार्बनिक / जलीय निष्कर्षण और शुद्धिकरण तकनीकों की आवश्यकता होती है। यह लेख विश्लेषणात्मक और पूर्ववर्ती पैमाने पर गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण, शुद्धिकरण, और पतली परत क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण का अवलोकन प्रदान करता है।
Abstract
गैंग्लियोसाइड्स ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स होते हैं जिनमें एक या अधिक सियालिक एसिड अवशेष होते हैं। वे सभी कशेरुक कोशिकाओं और ऊतकों पर पाए जाते हैं लेकिन मस्तिष्क में विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में होते हैं। मुख्य रूप से कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक पर व्यक्त किया जाता है, वे पार्श्व संघ के माध्यम से सेल सतह प्रोटीन की गतिविधियों को संशोधित करते हैं, सेल-सेल इंटरैक्शन में रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करते हैं और रोगजनकों और विषाक्त पदार्थों के लिए लक्ष्य हैं। मनुष्यों में गैंग्लियोसाइड जैवसंश्लेषण के आनुवांशिक विकृति के परिणामस्वरूप गंभीर जन्मजात तंत्रिका तंत्र विकार होते हैं। उनकी एम्फीपैथिक प्रकृति के कारण, निष्कर्षण, शुद्धिकरण और गैंग्लियोसाइड्स के विश्लेषण के लिए उन तकनीकों की आवश्यकता होती है जिन्हें उनकी खोज के बाद से 80 वर्षों में कई जांचकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया गया है। यहां, हम निष्कर्षण, शुद्धिकरण, और ऊतकों और कोशिकाओं से प्रमुख गैंग्लियोसाइड्स के प्रारंभिक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बेंच-स्तर के तरीकों का वर्णन करते हैं जिन्हें कुछ घंटों में पूरा किया जा सकता है। हम मस्तिष्क से बड़े पैमाने पर अलगाव और प्रमुख गैंग्लियोसाइड प्रजातियों के शुद्धिकरण के तरीकों का भी वर्णन करते हैं। साथ में, ये विधियां बायोएक्टिव अणुओं के इस वर्ग के लिए विश्लेषणात्मक और पूर्ववर्ती पैमाने पर पहुंच प्रदान करती हैं।
Introduction
गैंग्लियोसाइड्स को ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स के रूप में परिभाषित किया गया है जो एक या अधिक सियालिक एसिड अवशेषों को सहन करते हैं1। वे मुख्य रूप से कोशिका की सतह पर व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें उनके हाइड्रोफोबिक सेरामाइड लिपिड समूह प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक में एम्बेडेड होते हैं और उनके हाइड्रोफिलिक ग्लाइकन बाहरी स्पेस 2 में विस्तारित होते हैं। यद्यपि कशेरुक कोशिकाओं और ऊतकों में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है, वे विशेष रूप से कशेरुकी मस्तिष्क 3 में प्रचुर मात्रा में होते हैं, जहां उन्हें पहली बार खोजा गया था और नामित किया गया था4।
गैंग्लियोसाइड ग्लाइकन की संरचनाएं अलग-अलग होती हैं और उनके नामकरण का आधार होती हैं (चित्रा 1)। गैंग्लियोसाइड ग्लाइकन में एक तटस्थ चीनी कोर शामिल होता है जो विभिन्न संख्याओं और सियालिक एसिड के वितरण को सहन करता है। सबसे छोटे गैंग्लियोसाइड, जीएम 4 में केवल दो शर्करा (गैलेक्टोज से बंधे सियालिक एसिड) होते हैं। बड़े स्वाभाविक रूप से होने वाले गैंग्लियोसाइड्स में एक दर्जन से अधिक कुल शर्करा 6 या एक एकल तटस्थ कोर 7 पर सात सियालिक एसिड तक हो सकते हैं। उनके सेरामाइड लिपिड moieties भी भिन्न होते हैं, जिसमें विभिन्न स्फिंगोसिन लंबाई और विभिन्न प्रकार के फैटी एसिड एमाइड्स होते हैं। कशेरुक मस्तिष्क में चार गैंग्लियोसाइड प्रजातियां, GM1, GD1a, GD1b और GT1b प्रबल हैं। गैंग्लियोसाइड अभिव्यक्ति विकासात्मक रूप से विनियमित, ऊतक विशिष्ट और सेल प्रकार विशिष्ट है।
चित्रा 1: प्रमुख मस्तिष्क गैंग्लियोसाइड्स और उनके बायोसिंथेटिक अग्रदूत। संरचनाओं को ग्लाइकन 11 के लिए प्रतीक नामकरण का उपयोग करके दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Gangliosides अपने स्वयं के झिल्ली (सीआईएस विनियमन) में प्रोटीन को उलझाने और मॉड्यूलेट करके या अन्य कोशिकाओं (ट्रांस मान्यता) पर बैक्टीरिया विषाक्त पदार्थों और लेक्टिन सहित बाहरी परिवेश में ग्लाइकन बाध्यकारी प्रोटीन को शामिल करके आणविक स्तर पर कार्य करते हैं। नियामक प्रोटीन के लिए गैंग्लियोसाइड्स के विशिष्ट बंधन और / या लिपिड राफ्ट में अन्य अणुओं के साथ आत्म-सहयोग के परिणामस्वरूप सेल व्यवहार में परिवर्तन होता है जो तंत्रिका तंत्र की संरचना और कार्य, कैंसर की प्रगति, चयापचय, सूजन, न्यूरोनल प्रोटीनोपैथी और संक्रामक रोगों को प्रभावित करता है। उनकी विविध सेलुलर भूमिकाओं के कारण, उनके अलगाव और विश्लेषण के लिए तरीके शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के विनियमन में बढ़ी हुई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। यहां, तेजी से छोटे पैमाने पर निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए मान्य तरीके, और मस्तिष्क से गैंग्लियोसाइड्स के पूर्ववर्ती पैमाने पर अलगाव प्रदान किए जाते हैं। अन्य ऊतकों के लिए आवेदन के लिए अवसरों और चुनौतियों पर चर्चा की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
छोटे और बड़े पैमाने पर गैंग्लियोसाइड निष्कर्षण और अलगाव के लिए विधियां यहां रिपोर्ट की गई अद्वितीय नहीं हैं – कई अलग-अलग विलायक निष्कर्षण और शुद्धिकरण दृष्टिकोण हैं जो उत्कृष्ट परिणाम प्रदान करते <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) कॉमन फंड फॉर ग्लाइकोसाइंस अनुदान U01CA241953 द्वारा समर्थित किया गया था। एमजेपी को जॉन्स हॉपकिन्स (T32GM080189) में रसायन विज्ञान-जीव विज्ञान इंटरफ़ेस कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | for collecting HPLC fractions |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe – Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Choose appropriate volume option |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | custom packed | other sizes available |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe – Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | For ganglioside storage |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
References
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