실험실 클래스에서 D1S80 로커스를 사용하여 DNA 지문 응용 프로그램

참고: 이 프로토콜은 학생 또는 각 법적 보호자가 유전 적 프로필이 유전 적 관계에 대한 통찰력을 제공하기 때문에이 프로토콜의 전도성에 동의하는 경우에만 사용됩니다. DNA 지문은 주로 인구 연구 및 법의학 문제에 적용되는 일반적인 분자 생물학 방법입니다. 따라서 오염 위험을 가능한 한 낮게 유지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 외부 소스 또는 DNases에서 DNA와 샘플의 오염을 방지 하려면, 장갑을 착용 해야, 악기철 세척 또는 살균 해야 하 고 솔루션 필터 살균 또는 사용 전에 자동화 해야. 1. 부칼 점막 상피 세포의 수확 주의: 타액 및 상피 세포와 함께 작동하면 전염병의 전염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 표준 및 전송 기반 예방 조치(예: 적절한 개인 보호 장비 사용)를 적용해야 합니다. 참고: 강사가 제공하는 양수 제어(예: 강사가 추출한 DNA)를 포함하고 다운스트림 처리 단계에 포함됩니다. 표본 수집 전에 치아를 먹거나 닦은 후 적어도 1 시간 동안 기다립니다. 빈 및 멸균 2.0 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 라벨. 포장에서 멸균 부칼 면봉 1개를 제거하고 뺨 안쪽에 30-40회 또는 30-40초 동안 힘차게 문지르며 부칼 점막 상피 세포를 수확합니다. 컬렉션의 끝을 이전에 표지된 멸균 미세 원심분리기 튜브에 넣고 손으로 또는 멸균 가위를 사용하여 가장자리를 넘어 확장되는 플라스틱의 길이를 분리합니다. 캡을 튜브에 단단히 고정하여 컬렉션 면봉을 내부에 밀봉합니다. 2. 인간 세포에서 게놈 DNA추출 추출하기 전에 시료 용해용열 믹서 또는 가열 블록을 65°C로 설정합니다.주의: 사용되는 일부 화학 물질은 유해로 분류됩니다. 안전 데이터 시트를 주의 깊게 읽고 취급 하기 전에 적절한 안전 조치를 취하십시오. 필요한 모든 완충제 및 용액(용액 8M 아세테이트, 2-프로판올, 70% 에탄올 및 용출 버퍼)을 필터링하거나 자동화하여 준비 및 소독합니다.참고: 모든 원심분리 단계는 명시되지 않는 한 실온(20-30°C)에서 수행해야 합니다. 용액 500 μL(50mM Tris/HCl, pH 8.0; 10mM 에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA); 2% 나트륨 도데실 황산염(SDS))을 부칼 스왑에 추가하여 시료가 용액에 완전히 침지되도록 합니다. 소용돌이는 적어도 5 초 동안 적극적으로. 10 분 동안 열 믹서에서 65 °C에서 샘플을 배양합니다. 배양 중에 펄스 소용돌이로 샘플을 3-4회 혼합합니다. 리시스 버퍼에서 면봉을 제거하고 튜브 내부를 대고 면봉을 눌러 최대 샘플 볼륨을 얻습니다. 8M 칼륨 아세테이트100μL을 용액 세포에 추가합니다. 흰색 침전이 있을 때까지 튜브를 반전시켜 철저히 섞습니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오. 원심 분리기 는 18,000 x g에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 퍼블럼의 450 μL을 깨끗하고 멸균된 1.5mL 마이크로센트심리분리기 튜브로 옮기다. 2-프로판올 450 μL을 추가하고 튜브 (DNA의 강수량)를 반전시켜 철저히 섞습니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오. 원심분리기 는 18,000 x g에서5 분 동안. 상체를 버리고 깨끗한 종이 타월에 튜브를 반전하여 펠릿을 건조시키고 교차 오염을 피하십시오. 펠릿을 완전히 건조시키기 위해 가열 블록에서 65 °C에서 5 분 동안 DNA를 배양합니다. DNA를 세척하려면 70% 에탄올의 500 μL을 추가합니다. 원심분리기 18,000 x g에서1분 동안. 상체를 버리고 깨끗한 종이 타월에 튜브를 반전하여 펠릿을 건조시합니다. 30 μL의 재서스펜션 버퍼(10m Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)를 펠릿에 추가합니다. DNases를 비활성화하기 위해 가열 블록에서 65 °C에서 10 분 동안 DNA를 배양합니다. 3. PCR을 사용하여 D1S80 VNTR 궤적 증폭 참고: 필요한 플라스틱 및 기타 재료를 수집하기 전에 필요한 시약 및 볼륨으로 작업표를 사용하고 작업표를 준비합니다. 멸균 튜브/스트립/플레이트에 샘플 번호로 PCR에 사용할 라벨을 지정합니다. PCR을 검증하기 위해 DNA 대신H2O를 사용하는 음성 제어와 양성 제어(예: 강사가 제공한 DNA 사용)를 포함하는 것을 기억하십시오. 5x PCR 반응 버퍼(15m MgCl2포함), 데옥시리보뉴클레오티드 트리포산염 1μL(dNTP) (10mMMM), 5 μL(10pmol)을 포함하는 1x PCR 마스터 믹스를 각 프라이머 pMC의 준비 카사이 외에 따르면 T118-f 및 pMCT118-r (포워드 – 5′-GAAACTGGCCTCCAACCCAACGCGCCG-3′, 역 – 5′-GTCTTGTTGGGTGTCCTGCCTGC-3′) 초순수H2O의2,23.8 μL, 및 Taq DNA 폴리머라제의 0.2 μL (5 U/μL).참고: 프라이머 pMCT118-f/pMCT118-r은 전체 궤적을 증폭시키는 D1S80 VNTR 영역의 측면 영역에 설계되었습니다. PCR 튜브/스트립/플레이트에 사용할 샘플 번호로 레이블을 지정합니다. 각 표지된 PCR 샘플 튜브 또는 잘 마스터 믹스의 Aliquot 45 μL. 각 PCR 튜브/플레이트의 마스터 믹스에 DNA 템플릿의 5μL을 추가하여 총 50μL의 피펫 팁을 변경하여 교차 오염을 방지합니다. DNA 대신 초퓨어 H2O를 사용하여 템플릿 제어(NTC)를 포함하지 않습니다. PCR 튜브 / 스트립을 닫거나 씰 플레이트를 닫고 혼합하십시오. 테이블 탑 원심분리기를 사용하여 20초 동안 PCR 튜브/스트립/플레이트원심분리기를 제공합니다.참고: 본 프로토콜에 주어진 PCR 조건은 사용된 DNA 폴리머라제 및 PCR 열 사이클러를 사용하여 최적화되었다. 일반적으로, PCR 조건은 DNA 중합체에 적응되어야 합니다. Taq DNA 폴리머라제의 표준 연장 시간은 1분/kb입니다. 샘플 튜브/스트립/플레이트를 열사이클러에 놓고 다음 조건(DNA 폴리머라제 연장 시간)을 사용하여 반응을 배양하십시오: 2분 동안 95°C의 1사이클; 15s용 94°C의 25사이클, 15s용 60°C, 30s용 72°C; 10 분 동안 72 °C의 1 주기. 프로그램이 완료되면, 열순환기에서 제품을 제거하고 전기 전구가 될 때까지 하룻밤 동안 4 °C 또는 -20 °C에 저장합니다. 4. PCR 제품의 아가로즈 젤 전기 전광 1.5% 아가로즈 젤을 준비합니다. 아가로즈 파우더 1.5g을 사용하고 1x 트리아세테이트-EDTA(TAE) 버퍼 용액100mL과 플라스크에 섞는다. 전자 레인지 (600 W)에서 혼합물을 약 1.5-2 분 동안 가열합니다. 필요한 경우 내용물과 열을 다시 소용돌이어 아가로즈를 완전히 녹입니다. 약간 식히고 아가로즈에 PeqGreen 2 μL을 추가합니다. 모든 샘플에 충분한 우물이 있는 빗을 사용하여 형태로 젤을 붓고 적어도 하나의 분자량 마커를 추가합니다.주의: 끓는 지체가 발생할 수 있습니다. 아직 용해되지 않은 아가로즈를 다시 일시 중단 할 때 플라스크를 조심스럽게 흔들어.참고: PeqGreen은 핵산검출을 위한 비독성 염료입니다. 이중 좌초 DNA (dsDNA) 및 단일 좌초 DNA (ssDNA) 뿐만 아니라 RNA의 염색에 적용 할 수 있습니다. 감도는 에티듐 브로마이드와 비슷합니다. PCR 제품을 4°C에서 제거하고 원심분리기는 약 10초 동안 제거합니다. 젤의 우물을 10 μL 샘플로 적재합니다. 젤을 과부하시키지 마십시오.참고: DNA 폴리머라제 버퍼에는 시료 밀도를 증가시키는 화합물이 포함되어 있어 시료를 적재하지 않고도 젤에 직접 적재할 수 있습니다. 이를 통해 샘플이 우물로 가라앉을 수 있으며 염료는 DNA 샘플이 얼마나 멀리 마이그레이션되었는지 추적하는 데 도움이 됩니다. 측면 우물에 분자량 표준을 추가하십시오(바람직하게는 50bp 분자량 표준).참고: 아가로즈 젤 전기포리가 반복되어야 하는 경우 -20°C에 잔류 PCR 샘플을 저장합니다. 약 40분 동안 또는 약 50bp로 이동하는 하부 노란색 염료 전면이 젤의 하부 끝에 도달할 때까지 1x TAE 러닝 버퍼로 젤을 실행한다. 청색광 또는 자외선(UV) 빛이 가해지는 동안 젤을 이미지화하고 조각 길이 분석을 위한 이미지를 기록한다.주의: 자외선은 눈과 피부를 손상시킬 수 있습니다. 자외선 차단제 사용 시 보호복과 자외선 안전 안경을 착용하십시오. 기관 유해 물질 정책에 따라 젤을 폐기하십시오. 5. 조각 길이 결과 분석 참고: 선형 회귀 분석을 사용하여 조각의 길이를 추정합니다. D1S80 PCR 조각을 크기 조정하기 위해, 50 bp 분자중량 표준 레인 위에 겔 사진에 눈자를 배치하여 눈금자의 상단이 샘플이 로드된 우물의 바닥과 일렬로 세워집니다(도1).참고: 분자량 표준(50bp 분자량 표준)에 대한 선형 회귀 방정식을 계산하기 위해 스프레드시트 프로그램이 사용되었다. 스프레드시트프로그램(그림 2)을이용하여 표에서 50bp 분자량 표준의 각 대역에 대한 우물(예를 들어, cm)으로부터의 거리를 기록한다. 50bp 분자량 표준의 각 단편 크기의 로그(예를 들어, 베이스 10)를 결정하고 로그 값을테이블(도 2)에입력한다. 각 데이터 점을 세로축(y축)에 대역 크기의 로그를 가진 그래프로 플롯하고, 스캐터플롯(그림3)을사용하여 분자량 표준의 각 대역까지 겔의 상단에서 측정된 실행 거리를 플롯한다. 추세선(선형 회귀 선)에 맞추고 회귀 방정식(y = 도끼 + b) 및그래프(그림 4)에R2 값을 표시합니다. 각 D1S80 앰플리시온(그림5)에대해 마이그레이션된 거리(예를 들어 cm)를 측정합니다. 회귀 방정식을 사용하여 각 D1S80 앰플리턴의 크기를 추정합니다: y = 도끼 + b여기서 y = 조각 크기의 로그a = 선의 기울기(점 5로 계산)x = 우물에서 거리 (cm)b = 회귀 선이 y축을 가로채는 점(점 5에서 계산)참고: y-값은 조각 크기의 로그를 나타내므로 D1S80 앰플리턴의 bp에서 조각 크기를 얻으려면 안티로그(10y)를계산해야 합니다. 6. 테스트 된 개인의 알레일에서 반복 단위의 수를 추정 참고: D1S80 반복 장치는 길이가 16bp입니다. D1S80의 가장 작은 알려진 적칭 에 는 14개의 반복이 있습니다. 여기에 설명된 앰플리통 방식은 최종 크기에 145 bp를 추가한 측면 영역을 가진 앰플리통을 생성합니다. 표 1을 사용하여 각 PCR 조각에 포함된 반복 단위 수를 추정합니다. 선형 회귀를 사용하여 추정된 크기는 특정 각선의 8bp 이내여야 합니다. 각 테스트 된 개별의 유전자형을 유전자 반복 크기 번호의 조합으로 기록합니다.