ヒトCRISPR設計CAR-T細胞の製造

キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞療法は、養子細胞療法および癌免疫療法の分野に革命をもたらしています。CAR-T細胞は、T細胞活性化および共刺激^に必要かつ十分なTCRzeta鎖および共刺激ドメインに由来するシグナル伝達ドメインと抗原特異的単鎖抗体断片を結合した合成免疫受容体を発現するT細胞を設計する^{1、2、3、4}.CAR-T細胞の製造は、患者自身のT細胞を抽出し、続いてCARモジュールのex vivoウイルス伝達と、人工抗原提示細胞として機能する磁気ビーズを有するCAR-T細胞産物の拡張を行う^。拡張されたCAR-T細胞は、それらが生着し、標的腫瘍細胞を排除し、さらに注入^後6、7、8の複数年間持続することができる患者に再注入される。CAR-T細胞療法はB細胞悪性腫瘍において顕著な応答率をもたらしたが、固形腫瘍の臨床的成功は、T細胞浸潤不良^9、免疫抑制性腫瘍微小環境^10、抗原被覆および特異性、CAR-T細胞機能障害^11、12を含む複数の要因によって挑戦されてきた。.現在のCAR-T細胞療法のもう一つの制限は、自家T細胞の使用を含む。化学療法と高腫瘍負担の複数のラウンドの後、CAR-T細胞は、自家CAR-T細胞の製造に関連する時間と費用に加えて、健康なドナーからの同種CAR-T製品と比較して質が悪い場合があります。CRISPR/Cas9によるCAR-T細胞産物の遺伝子編集は、CAR-T細胞13、14、15、16、17の現在の限界を克服するための新しい戦略を表す。

CRISPR/Cas9は哺乳動物細胞^18,19における標的ゲノム編集に使用できる2つの構成要素システムである。CRISPRに関連するエンドヌクレアーゼCas9は、標的DNA配列²⁰との塩基対を介して小さなRNAによって導かれる部位特異的な二本鎖破断を誘発し得る。修復テンプレートがない場合、二本鎖破断は、誤差が起こりやすい非相同端結合(NHEJ)経路によって修復され、挿入および欠失突然変異(INDELs)19、20、21を介してフレームシフト突然変異または早期停止コドンをもたらす。効率、使いやすさ、費用対効果、多重ゲノム編集能力により、CRISPR/Cas9は自家細胞や異系CAR-T細胞の有効性と安全性を高める強力なツールです。この方法は、CAR コンストラクトを TCR に置き換えることで、TCR 方向 T セルを編集する場合にも使用できます。さらに、移植片対宿主病を引き起こす可能性が限られている同種CAR-T細胞は、TCR、b2m、およびHLA遺伝子座を編集することによっても生成され得る。

このプロトコルでは、T細胞のCRISPRエンジニアリングとCARトランスジーンのウイルスベクター媒介送物を組み合わせて、有効性と安全性を高めるゲノム編集CAR-T細胞製品を生成する方法を示す。図 1に、プロセス全体のスケマティック ダイアグラムを示します。この手法を用いて、ヒトCAR-T細胞の高効率遺伝子ノックアウトを実証しました。 図2A は、T細胞を編集および製造するための各ステップのタイムラインを詳細に説明する。このアプローチをさまざまな標的遺伝子に適用するために、ガイドRNA設計およびノックアウト検証のための戦略も議論されています。