急性マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウム動態の共焦点レーザー走査顕微鏡

注:すべての実験は、研究における動物の世話と使用に関する機関のガイドラインに厳密に従って実施されました。このプロトコルは、スロベニア共和国食品安全、獣医部門および植物保護のための管理局によって承認されました(許可番号:34401-35-2018/2)。 1. 膵臓組織スライスの調製 注:CLSMを用いたカルシウムイメージング用の急性マウス膵臓組織スライスの調製は、多数の器具、異なる溶液を必要とし、 図1 に概略的に提示され、以下に詳述される一連の重要なステップで進行する。 図1:ワークフロー図膵臓組織スライス調製の過程におけるすべてのステップの概略図は、総胆管へのアガロースの注入から始まり、続いて膵臓の抽出およびスライスによって開始される。調製されたスライスは、Live/Deadキットで組織の生存率を評価するために、またはカルシウムセンサーで染色するために使用することができる。染色されると、イメージングの準備が整います。その後、イメージングプロセスから得られた記録は、データ分析に使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 溶液の調製注:すべての溶液は事前に準備する必要があり、4〜8°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保存することができます。組織スライスの調製および保存のためには、6mMグルコースおよび0.3Lの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を含む約0.5Lの細胞外溶液(ECS)が必要である。1~2mL/分の流速に設定した周囲融合システムによる1日間のカルシウムイメージングでは、約0.5LのECSが必要です。 6 mM グルコースを含む細胞外溶液 125 mM NaCl、26 mM NaHCO 3、6 mM グルコース、6 mM 乳酸、3 mM ミオイノシトール、2.5 mM KCl、2 mM Naピルビン酸、2 mM CaCl 2、1.25 mM NaH 2 PO4、1 mM MgCl2、および 0.5 mM アスコルビン酸を含む 1L の ECS を調製します。すべての成分が完全に溶解するまで十分に混合する。50 μLのECSを0.5 mLの微量遠心チューブに入れ、製造元の指示に従って浸透圧計の上に置き、浸透圧を確認してください。注:浸透圧は300-320 mOsmでなければなりません。ベータ細胞の刺激のために、より高いグルコース濃度の溶液を使用する。スライスおよび実験中に生理学的pH値が7.4であることを保証するために、気圧下でカルボゲン(すなわち、95%O2 および5%CO2の混合ガス)でECSを絶えずバブリングする。簡単なバブリングシステムは、5mmシリコンチューブの一方の端をカルボゲンの供給源(すなわち、加圧ガスボンベ)に取り付け、チューブの他端をECSを含むボトルに直接取り付けることによってセットアップすることができる。 あるいは、1250 mM NaCl、260 mM NaHCO3、30 mM ミオイノシトール、25 mM KCl、20 mM Naピルビン酸、12.5 mM NaH2PO4、および 5 mM アスコルビン酸を含む 10x ストックを調製します。6 mM グルコースを含む ECS が必要な場合は、100 mL のストックを 2 mL の 1 M CaCl 2、1 mL の 1 M MgCl 2、0.455 mL の13.2 M 乳酸、および 1.08 g のグルコースと混合し、1 L までの二重蒸留水で満たします。必要に応じて、異なる量のグルコースを使用して、他のグルコース濃度を得る。 6 mM グルコースを含む HEPES緩衝液 150 mM NaCl、10 mM HEPES、6 mM グルコース、5 mM KCl、2 mM CaCl 2、および 1 mM MgCl2 を含む 0.5 L の HEPES 緩衝溶液 (HBS) を調製する。1 M NaOHでpH=7.4に滴定する。メモ: carbogen が使用できない場合は、ECS の代わりにこのバッファをすべてのステップに使用できます。 アガロース (1.9% w/w) 水浴を40°Cに予備加温する。 0.475gの低融点アガロースおよび6mMグルコースを含むECS25mLを三角フラスコに加え、フラスコを最大電力で電子レンジに入れ、沸騰し始めるまで数秒間置く。オーブンからフラスコを取り出し、アガロースが完全に溶解するまで数回旋回させる。液体アガロースの入ったフラスコを40°Cの予温水浴に移し、アガロースを所望の温度に冷却し、注射まで液体に保つ。フラスコを安定化リードリングで固定します。注:アガロースは事前に準備し、冷蔵庫に保管することができます。使用前に、電子レンジでアガロースを液化するまで加温し、三角フラスコを40°Cに予備加温した水浴に移した。 アガロースは最大5倍まで再利用できます。5倍を超えて再利用すると、密度が高くなり、注入が難しくなります。 アガロースによる膵臓の注射注:セクション1.2および1.3では、カルシウムイメージング、電気生理学、免疫組織化学、分泌研究、構造/微小解剖学的研究などのさまざまな実験目的に使用できる組織スライスの調製について説明します。ステップ1.1.3.2の水浴中の三角フラスコからの液体アガロースで5mLシリンジを満たし、気泡を除去し、30G針を取り付ける。針をキャップで保護し、充填されたシリンジを水浴に戻し、針を下向きにし、アガロースの全量を水面下に置きます。リングがシリンジを水浴の壁に押し付けるように、シリンジを安定化リードリングで固定します。注:アガロースはすぐに固まって針をふさぐので、針に押し込まないように注意してください。室温が低く、注射が経験の浅い人によって行われる場合は、水浴の温度を42°Cまで上げて、注射のための追加の時間を得る。 アイスバケツに氷を入れ、ECSの入ったボトルを入れます。ECSを気圧と室温でカーボーゲンで常に1.5mL/minでバブリングして、酸素化とpH7.4を確保します。 高濃度のCO2 を投与してマウスを屠殺し、続いて子宮頸部脱臼を行う。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力をしてください。 実体顕微鏡下で作業し、開腹術を介して腹部にアクセスする(図2A)。(マウスの解剖学的観点から)マウスの左側に腸を静かに反転させて、総胆管を露出させる。鉗子を使用して十二指腸部分をわずかに持ち上げ、Vaterの主要な十二指腸乳頭 – 乳頭を見つけます。止血剤(図2B、C)を使用して十二指腸乳頭の総胆管をクランプし、ダクトから十二指腸へのアガロースの漏れを防ぎます。注:十二指腸へのアガロースの漏れを防ぎ、さらに胃腸管内で上下に、乳頭から近位および遠位の両方で十二指腸をクランプするように止血剤を配置します。この目的のために湾曲した止血剤を使用するのが最善です。 小さな鋭い鉗子で、総胆管の下に到達し、管を膵臓組織に付着させる膜を壊す。より良い視覚的制御とより簡単な注射のために、できるだけ多くの脂肪と結合組織をダクトから取り除きます。 ダクトを大きな鉗子の上に垂直に置き(図2D)、調製した液体アガロースを総胆管の近位部分に注入する(図2D)。アガロースは粘性があるので、シリンジを強く絞ってください。膵臓が白っぽくわずかに外れるまで、または少なくとも20〜30秒間、膵臓を満たし続けます。メモ: これは、スライスの準備において最も重要なステップです。膵臓の管の木にねじれがある場合は、膵臓を静かに上昇させるか、注射器から引き離して平らにします。注射点の逆流および十二指腸への前方漏出は、典型的には膵臓の管状木に注入された体積よりもはるかに高いので、注射器から注入された体積に基づいて注射を停止する時期を決定しないでください。重要なことに、成功した注射は、注射器容積の実質的に目立たない変化で行うことができる。 シリンジを取り出し、20mLの泡立てた氷冷ECSをボトルから膵臓に0〜4°Cでゆっくりと注ぎ、組織を冷却し、アガロースを硬化させる。 鉗子と細かい丈夫なはさみを使って膵臓を優しく抽出します。抽出した膵臓を、約40mLの氷冷ECSを含む100mmのペトリ皿に入れ、静かに動かして洗浄する。膵臓を、約40mLの氷冷ECSを含む新鮮な100mmペトリ皿に移す。 白っぽく見える膵臓のよく注入された部分から(図3A)、鉗子と丈夫な切断はさみを使用して、0.1〜0.2cm3の大きさの組織の6ブロックまで切断する。結合組織や脂肪組織を取り除いてください。 35mmの非粘着性の底部シャーレに約5mLの液体アガロースを40°Cで満たし、組織ブロックをその中に移し、すぐにペトリ皿を氷の上に置き、冷却してアガロースを硬化させる。注:膵臓のブロックがアガロースに閉じ込められる方法は、スライス中に切断される方法を決定します。経験豊富な実験家は、氷の上に置かれたときにアガロースが固まる前の数瞬の間にブロックの位置を微調整しようとすることができます。 組織ブロックの付いたアガロースが固まったら、100mmのシャーレの蓋などの平らな滑らかな面にペトリ皿を逆さまにし、カミソリの刃の半分でペトリ皿の側壁とアガロースの間の隙間に軽く切ってアガロースを取り除きます。カミソリの刃で、それぞれが1つの組織ブロックを含む個々のアガロース立方体を切り取り、各組織ブロックがアガロースに囲まれるように注意する。アガロースブロックをシアノアクリレート接着剤でビブラトームのサンプルプレートに接着する(図3B)。 図2:総胆管へのアガロースの注射 (A)腹腔を開き、腹腔内の器官を露出させる。(B)パネル Aの長方形で囲まれた領域の拡大部分。十二指腸の白い斑点(矢印で示す)は、Vaterのアンプラを示しています。ランゲルハンス島は矢じりで示されています。(C)湾曲した止血剤でVaterのアンプラをクランプし、それをわずかに上げて露出させ、総胆管を静かに伸ばす(矢印)。(d)総胆管の開頭および5mLシリンジおよび30G針を用いた1.9%アガロース溶液の注射。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 スライス ビブラートームの切断チャンバを〜0.15Lの氷冷ECSで満たし、カルボゲンで絶えず泡立てる。切断チャンバを氷で囲み、6mMグルコースを含むECS製の2つのアイスキューブ(それぞれ約10mL)を切断チャンバに加える。切断用のカミソリの刃をビブラトームに取り付け、サンプルプレートをアガロースブロックで所定の位置にネジ固定します。 アガロースブロックを0.05~1mm/s、70Hzで切断し、表面積20~100mm2の厚さ140μmのスライスにスライサーをセットします。スライサーの設定については、製造元の指示に従います。 各切断ステップの直後に、スライサーを一時停止し、細かいペイントブラシでスライスを静かに収集し、室温で6mMグルコースを含む40mLのHEPES緩衝液で満たされた100mmシャーレに移す(図3C)。メモ: スライスは室温の HEPESバッファーに少なくとも 12 時間保管でき、バッファーは 2 時間ごとに交換する必要があります。 図3:膵臓組織調製およびスライス。左側の白い組織は、よく注入された部分(十二指腸部分)を示し、右側のより赤みを帯びた部分は、膵臓の不十分な注入部分(脾臓部分)を示す。(b)アガロースに埋め込まれた膵臓組織の2ブロックのビブラトームスライス。(c)矢じりで示されたランゲルハンスの膵島を有する急性膵臓組織切片。(D)ランゲルハンス膵島を有する光学顕微鏡下の急性膵臓組織スライスは矢印で示し、アスタリスクは膵管を示す。スケール バー = 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2. 哺乳類細胞に対するLIVE/DEAD生存率/細胞毒性キットを用いた生/死アッセイ 注:一部の実験では、スライス内の細胞の生存率(図4)を以下のように生/死アッセイによって確認することが有用である。 製造元の指示に従って、LIVE/DEAD生存率/細胞毒性キットの試薬でバイアルを解凍し、使用直前にカルセインAMの作業溶液を調製します。1日以内にソリューションを使用してください。 15 mL 遠沈管で、5 μL の 4 mM カルセイン AM (成分 A)、20 μL の 2 mM エチジウムホモダイマー-1 (EthD-1、成分 B)、および 10 mL のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS) を混合して、約 2 μM カルセイン AM および 4 μM EthD-1 を含む作業溶液を調製します。徹底的に渦。 細かいペイントブラシを使用して、組織スライスを新鮮なHEPES緩衝液で3mLのシャーレに静かに移し、血清エステラーゼ活性を希釈する。HEPESバッファーを除去し、スライスをステップ2.2の作業溶液の100〜200μL(または必要に応じてそれ以上)で覆う。 スライスを密閉シャーレ中で室温で30〜45分間インキュベートする。製造元の推奨に従って励起/発光フィルターを使用して組織スライスを画像化します。 3. カルシウム染料ローディング 注:蛍光色素は、色素の調製および装填の全プロセス中、ならびに染色された組織スライスの取り扱い中に、光曝露から遮蔽されるべきである。スズ箔は、カルシウム染料を含むチューブまたはペトリ皿を覆うために使用することができる。 染料調製 細胞透過性Ca2+指示色素(励起/発光495/523nm ; 材料表参照)、ジメチルスルホキシド(DMSO)7.5μL、およびポラクサマー2.5μL(DMSO中の20%溶液; 材料表)6.667mLのHBSを15mLスクリューキャップチューブに6mMグルコースを含む。注:この最終溶液には、6μMのCa2+ 指示色素、0.11%DMSO、および0.037%ポラクサマーが含まれています。 スクリューキャップチューブ内の溶液をピペットで20秒間繰り返し吸引して排出する。可溶化を改善するために、チューブを超音波浴槽に30秒間、渦を30秒間浸漬する。ステップ3.1.1で調製した最終Ca2+ 指示色素溶液のアリコート3.333 mLを5 mLペトリ皿にアリコートする。 染料ローディング HBSで調製した組織スライスを60mLシャーレから色素溶液で満たされた5mLシャーレに移し、薄くて柔らかいペイントブラシを用いて各組織スライスを静かに持ち上げ、それを色素溶液に入れる。ペトリ皿あたり最大10個の組織スライスをインキュベートする。 スライスを載せたペトリ皿を、毎分40ターンで軌道運動するように設定された室温のオービタルシェーカー上に50分間置く。スライスを室温で周囲空気に曝した色素溶液中でインキュベートするが、ペトリ皿を錫箔で覆うことによって光から遮蔽する。 スライスの保存 染色した組織スライスを5mLのシャーレから、色素を含まないHBSで満たされた60mLのシャーレに、細かく柔らかいペイントブラシを使用して静かに持ち上げることによって移す。ペトリ皿あたり最大20スライスを保管してください。メモ:この時点でイメージングには、組織スライスを使用してください。組織スライスは、Ca2+ 指示色素を数時間保持する。スライスの生存率および染料の保持は、氷に囲まれた断熱容器にペトリ皿を置くことによって改善することができる。これは、染料を装填したスライスを輸送する場合に特に重要です。さらに、HBS を 2 時間ごとに交換します。 4. カルシウムイメージング 共焦点顕微鏡のセットアップ 研究の関心に応じて適切な目的倍率を選択します。20x と 25x (開口数 [NA] 0.77-1.00) を選択して、膵島全体、複数のアシニを同時に、またはより大きなダクトを視覚化します。細胞内ダイナミクスを研究するためにより高い倍率を選択してください。 タイムラプスイメージングの集録モード( タイムラプス、xyt、または同様のモードなど)を選択します。ピンホールを100~200μmに設定します。 緑色蛍光色素分子の光路を 488 nm で励起し、500 ~ 700 nm で発光の収集を設定します。好ましくは、光電子増倍管検出器よりも高い量子効率を有する検出器(例えば、リン化ガリウム砒素)を選択する。 記録チャンバとペリフュージョンシステムのセットアップ 記録チャンバを顕微鏡の温度制御ステージとペリフュージョンシステム(重力供給またはペリスタルティックポンプベースのセットアップ、容量1mL)に取り付けます。チャンバー内の灌流液が蛇行しないように、入口と出口を記録チャンバーの遠端に配置し、流入と流出を等しい値(1~2mL/分)に設定します。液体メニスカスの高さと末葉液中の液滴の漂流を避けてください。 ペリフュージョンシステムの温度制御を37°Cに設定し、非刺激溶液でペリフュージョンを開始し、刺激溶液を準備する。電動バルブを介して、またはペリフュージョンシステムに供給するソリューションを手動で切り替えて、ソリューションを変更します。 カルシウムダイナミクスを記録する 単一の組織スライスを記録チャンバに移す。組織スライスを、張り詰めたナイロンメッシュ(例えば、ナイロンストッキングから)を有するU字型の白金重量で固定化する。ナイロン糸を目的の構造の上に配置しないでください。 明視野オプションを使用して、膵島/アシヌス/ダクトを見つけます。ライブイメージングを実行して、調査した構造物を視野に配置し、イメージングパラメータを設定します。レーザー出力、検出器増幅、ライン平均化/ビニングを調整して信号対雑音比を最適化し、レーザー出力を最小限に抑えながらセルを視覚化できるようにします。 記録の焦点面を切断面から約15 μm下(図5)に調整して、切断面で損傷する可能性のある細胞からの記録を避けます。 画像を取得します。サンプリング周波数を1~2Hzに設定して個々の振動を最初に検出し、高速ライン平均化(8~20)が可能な共振スキャナをより高い集録レート(>10Hz)で使用して細胞内のCa2+ ([Ca2+]IC)活動を記録します。光毒性を防ぐために、連続する点照明間の間隔(例えば、総サンプリング時間の30%)を許可する。時系列取得の前に高解像度画像(例えば、1024×1024ピクセル、線平均化>50)を記録する(セクション5参照)。注:1~2Hzのサンプリング周波数は、ほとんどのセルの集録周波数のナイキスト基準を下回っており、信号の形状はデフォルトでアンダーサンプリングされます。 オンラインチャート(イメージングソフトウェアで利用可能な場合)を参照して、試料作製応答、過照度、フォトブリーチング、および機械的ドリフトに関する即時フィードバックを取得します。集録中に漂白率が高い場合は、記録を停止してレーザー出力を下げながら、検出器のゲインを増やして信号対雑音比を維持します。機械的ドリフトの場合は、チューブ/ケーブルと顕微鏡ステージ間の張力、液体漏れ、記録チャンバ内の体積変化を確認してください。必要に応じて、集録中のドリフトを手動で補正してみてください。ただし、これは本質的に限られた結果しか得られないことに注意してください。注:内分泌細胞は、閾値に近い濃度で非常に不均一である。個々の細胞における活性化/不活性化遅延の範囲を検出するには、十分な長さの刺激が必要である。これは、高刺激プロトコルに従ったオフ応答の正確な検出に特に重要です。 カルシウムイメージングを使用して、エンドオクリン細胞と外分泌細胞を機能的に区別します(図6)。アクティブ化および非アクティブ化中の一時的なアクティビティを記録するには、記録を停止せずに刺激を適用します。 実験終了後にデータを保存します (自動保存機能の使用を検討してください)。シャットダウン手順中にレーザーを損傷しないように、レーザー電源をオフにする前に冷却期間を空けてください。 5. データの分析 タイムラプスビデオを再生して、記録を定性的に視覚的に検査します。視野または光学面からのセルドリフトを確認します。光学面内にドリフトが発生した場合は、ImageJのドリフト補正プラグインを使用します。 顕微鏡ソフトウェアまたはサードパーティ製ソフトウェアを使用して、関心領域(ROI)を選択します。高解像度の画像、最大投影、またはフレーム平均を基準として使用して、ROI を選択します。タイムラプスイメージングを再生して、参照画像には見えない応答細胞を視覚化します。ROI間のシグナルクロストークを避けるために、ROIの選択された領域が隣接するセルと重ならないようにROIを配置します。 時系列データをフレームあたりのROI平均値としてエクスポートします。ROI 座標をエクスポートします。 漂白のための時系列データ(図7A)を補正するには、指数適合と線形適合の組み合わせを採用します。(1)ここで、x(t)は、ある時点での蛍光シグナルを示す。xcorr(t) 対応する時点で補正された信号。a、b、および c は、corr(t) と x(t) の間の最小平方和として計算された適合のパラメータです。 応答の活性化フェーズと非アクティブ化フェーズを分析します(図7B)。時系列データの一次微分を計算し、活性化と非活性化に対応する微分の天頂と天底をそれぞれ求めます。または、段階的増加の開始を手動で選択します。アクティブ化/非アクティブ化時間と対応するセル座標を保存してエクスポートします。 プラトー相を分析します(図7C)。生データをしきい値にするか、時系列データの一次微分をしきい値にして、個々の振動を検出します。個々の振動の開始と終了を、振動の半振幅に対応する時間として定義します。 各セルの個々の振動の持続時間と周波数を計算します。スパイク間間隔の逆値を計算します (通常のアクティビティ パターンに適しています)。あるいは、振動数をレコードの時間間隔で割る(不規則なアクティビティパターンに適しています)。 アクティブ時間を計算します。アクティブな時間を期間の合計として表し、この値を時間間隔で割ります。または、振動に対応する周波数と持続時間を乗算します。注: 期間の合計を時間間隔で割ると、堅牢な結果が得られますが、セルごとに 1 つのデータ ポイントが得られるため、統計的な識別は低くなります。振動の周波数と持続時間を乗算すると、振動から振動への時間分解能が得られます。