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생물학

Microscopia a scansione laser confocale della dinamica del calcio in fette di tessuto pancreatico di topo acuto

Published: April 13, 2021
doi:
10.3791/62293
, , , , ,
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine,University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics,University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology,Medical University of Vienna

Summary

Presentiamo la preparazione di fette di tessuto pancreatico acuto e il loro utilizzo nella microscopia a scansione laser confocale per studiare la dinamica del calcio contemporaneamente in un gran numero di cellule vive, per lunghi periodi di tempo e con alta risoluzione spaziotemporale.

Abstract

La fetta di tessuto pancreatico acuto del topo è una preparazione unica in situ con comunicazione intercellulare preservata e architettura tissutale che comporta un numero significativamente inferiore di cambiamenti indotti dalla preparazione rispetto alle isole isolate, agli acini, ai dotti o alle cellule disperse descritte in tipici studi in vitro. Combinando la fetta di tessuto pancreatico acuto con l’imaging del calcio a cellule vive nella microscopia a scansione laser confocale (CLSM), i segnali di calcio possono essere studiati in un gran numero di cellule endocrine ed esocrine contemporaneamente, con una risoluzione a singola cellula o addirittura subcellulare. La sensibilità consente l’individuazione dei cambiamenti e consente lo studio delle onde intercellulari e della connettività funzionale, nonché lo studio della dipendenza delle risposte fisiologiche delle cellule dalla loro localizzazione all’interno dell’isolotto e la relazione paracrina con altre cellule. Infine, dal punto di vista del benessere degli animali, la registrazione dei segnali provenienti da un gran numero di cellule alla volta riduce il numero di animali richiesti negli esperimenti, contribuendo al principio di sostituzione, riduzione e raffinamento delle 3R.

Introduction

Il pancreas dei mammiferi è una grande ghiandola esocrina ed endocrina. La parte esocrina costituisce il 96-99% del volume totale del pancreas ed è costituita da acini e dotti. La parte endocrina è costituita da un gran numero di isole di Langerhans che rappresentano il restante 1-4% del volume totale del pancreas1. La parte esocrina secerne importanti enzimi digestivi che abbattono i polimeri ricchi di energia negli alimenti, così come un fluido ricco di bicarbonato, che si combina con altre secrezioni gastrointestinali per fornire un ambiente adatto all’azione degli enzimi. La parte endocrina secerne ormoni che regolano la distribuzione postprandiale, lo stoccaggio e il rilascio interprandiale di nutrienti ricchi di energia. Sebbene il tessuto esocrino sia relativamente sottosviluppato e l’endocrino relativamente ben sviluppato alla nascita, il primo cresce rapidamente il secondo allo svezzamento 2,3,4. I primi studi sulla funzione pancreatica hanno segnato la nascita della fisiologia moderna e importanti progressi metodologici nel campo sono stati seguiti da importanti interruzioni scientifiche5. Lavorare con il pancreas è tecnicamente impegnativo a causa dell’intricata struttura della ghiandola, ma è anche una grande motivazione a causa di malattie come il cancro al pancreas, la pancreatite e il diabete che presentano gravi minacce per la salute pubblica e per le quali sono necessari nuovi approcci terapeutici.

Le isole isolate6, acini 7,8 e frammenti duttali erano state sviluppate e utilizzate per decenni come metodi gold standard a causa dei loro vantaggi rispetto alle linee cellulari e alle cellule endocrine, acinore e duttali disperse primarie 9,10. Nonostante la funzione marcatamente migliorata dei collettivi cellulari isolati, questi metodi comportano ancora un notevole stress meccanico ed enzimatico, isolano le cellule dal tessuto circostante e quindi mancano di interazioni paracrine e supporto meccanico e, soprattutto, sono accompagnati da cambiamenti significativi nella fisiologia normale 11,12,13 . La fetta di tessuto pancreatico acuto del topo è stata sviluppata nel 2001 per una necessità percepita di sviluppare una piattaforma sperimentale simile a fette cerebrali, ipofisarie e surrenali con contatti intercellulari conservati, interazioni paracrine, mesenchima e architettura tissutale, nonché senza alcune delle più importanti carenze del metodo gold standard nella ricerca sulle isole di quel tempo – le isole isolate12, 14. Tra queste carenze ci sono i danni agli strati più esterni, la mancanza di accessibilità delle aree degli isolotti centrali e la necessità di coltivazione con effetti potenzialmente importanti sull’identità e la fisiologia cellulare12,15. Inoltre, il metodo della fetta di tessuto consente studi su modelli animali con architettura isolotta grossolanamente squilibrata in cui è impossibile isolare le isole, o quando la resa delle isole è estremamente bassa con l’isolamento tradizionale 16,17,18,19,20,21.

Inoltre, la fetta è più adatta per studiare i cambiamenti morfologici durante lo sviluppo del diabete e della pancreatite, ad esempio, in quanto consente una migliore panoramica dell’intero tessuto ed è anche compatibile con lo studio delle differenze regionali. È importante sottolineare che, nonostante l’attenzione iniziale sulla parte endocrina, il metodo della fetta di tessuto consente intrinsecamente lo studio dei componenti esocrini 9,22,23. Durante il primo decennio dopo la sua introduzione, il metodo è stato impiegato per studi elettrofisiologici di cellule beta 14,24,25,26,27,28,29 e alfa 30,31, nonché per esaminare la maturazione morfologica e funzionale del pancreas 2,3 . Un decennio dopo, nel 2013, il metodo è stato adattato con successo per l’imaging del calcio a cellule vive di cellule insulari utilizzando CLSM per caratterizzare le loro risposte al glucosio32, i loro modelli di connettività funzionale33 e la relazione tra potenziale di membrana e calcio intracellulare combinando un colorante di calcio fluorescente con un colorante a potenziale di membrana34. Più tardi nello stesso anno, il metodo è stato utilizzato anche per valutare la dinamica del calcio nelle cellule acinari22,35. Negli anni successivi, le fette di tessuto pancreatico sono state utilizzate in una serie di studi diversi e adattate con successo al tessuto suino e umano 9,36,37,38,39,40,41. Tuttavia, nel loro insieme, l’imaging del calcio nelle fette di tessuto pancreatico del topo in generale e nelle isole in particolare, è ancora per lo più eseguito da questo gruppo. Una delle ragioni principali di ciò potrebbe risiedere nella combinazione di una preparazione di fette di tessuto tecnicamente impegnativa, la necessità di un microscopio confocale e un’analisi dei dati piuttosto complessa. L’obiettivo principale del presente documento è quello di rendere questo potente metodo più accessibile ad altri potenziali utenti.

Esistono già alcuni eccellenti articoli metodologici che trattano in dettaglio la preparazione delle fette di tessuto e l’uso delle fette per studi strutturali e di secrezione, ma non per l’imaging confocale del calcio 9,42,43. Pertanto, questo documento si concentra su alcuni suggerimenti e trucchi aggiuntivi durante la preparazione delle fette, sui passaggi critici per il corretto caricamento del colorante, l’acquisizione delle immagini e sulle fasi principali dell’analisi dei dati di calcio di base. Pertanto, tale contributo dovrebbe essere considerato come complementare piuttosto che alternativo al metodo summenzionato. Analogamente, l’imaging del calcio nelle fette di tessuto pancreatico di topo deve essere considerato come un approccio sperimentale da utilizzare per rispondere a domande specifiche ed è quindi complementare piuttosto che un’alternativa assoluta per altri approcci di imaging del calcio nella fisiologia pancreatica come dotti isolati o acini, isole isolate, organoidi, isole trapiantate nella camera anteriore dell’occhio, e registrazioni in vivo 11,44,45,46,47,48. La promessa dell’imaging del calcio nelle fette di tessuto pancreatico del topo è probabilmente meglio illustrata dalle recenti registrazioni di successo della dinamica del calcio nelle cellule mesenchimali insulari come i periciti49 e i macrofagi50, così come nelle cellule duttali23.

Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in stretta conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l’uso degli animali nella ricerca. Il protocollo è stato approvato dall’Amministrazione della Repubblica di Slovenia per la sicurezza alimentare, il settore veterinario e la protezione delle piante (numero di autorizzazione: 34401-35-2018/2). 1. Preparazione di fette di tessuto pancreatico NOTA: La preparazione di fette di tessuto pancreatico acuto di topo per l’imaging del calcio utilizzando CLSM richiede una serie di strumenti, soluzioni diverse e procede in una serie di passaggi critici che sono schematicamente presentati nella Figura 1 e descritti in dettaglio di seguito. Figura 1: Diagramma del flusso di lavoro. Rappresentazione schematica di tutte le fasi del processo di preparazione della fetta di tessuto pancreatico, a partire dall’iniezione di agarosio nel dotto biliare comune, seguita dall’estrazione del pancreas e dall’affettamento. Le fette preparate possono essere utilizzate per valutare la vitalità del tessuto con un kit Live/Dead o colorate con un sensore di calcio. Una volta macchiati, sono pronti per l’imaging. Le registrazioni ottenute dal processo di imaging vengono quindi utilizzate per l’analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Preparazione di soluzioniNOTA: Tutte le soluzioni devono essere preparate in anticipo e possono essere conservate in frigorifero a 4-8 °C per un massimo di un mese. Per la preparazione e la conservazione di fette di tessuto, sono necessari circa 0,5 L di soluzione extracellulare (ECS) con 6 mM di glucosio e 0,3 L di tampone di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES). Per 1 giorno di imaging del calcio con il sistema di perifusione impostato a 1-2 ml / min di portata, è necessario circa 0,5 L di ECS. Soluzione extracellulare con 6 mM di glucosio Preparare 1 L di ECS contenente 125 mM naCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM di glucosio, 6 mM di acido lattico, 3 mM di mio-inositolo, 2,5 mM KCl, 2 mM Na piruvato, 2 mM CaCl2, 1,25 mM Di NaH2PO4, 1 mM MgCl2 e 0,5 mM di acido ascorbico. Mescolare accuratamente fino a quando tutti gli ingredienti si sciolgono completamente. Prendere 50 μL di ECS in un tubo microcentrifuga da 0,5 mL, posizionarlo sull’osmometro secondo le istruzioni del produttore e controllare l’osmolarità.NOTA: l’osmolarità deve essere di 300-320 mOsm. Per la stimolazione delle cellule beta, utilizzare soluzioni con concentrazioni di glucosio più elevate. Per garantire un valore di pH fisiologico di 7,4 durante l’affettamento e gli esperimenti, bollare costantemente l’ECS con carbogeno (cioè una miscela di gas del 95% O2 e del 5% di CO2) a pressione barometrica. Un semplice sistema di gorgogliamento può essere impostato collegando un’estremità di un tubo di silicio da 5 mm alla fonte di carbogeno (cioè una bombola di gas pressurizzata) e l’altra estremità del tubo posto direttamente nella bottiglia contenente ECS. In alternativa, preparare un 10x stock contenente 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM mio-inositolo, 25 mM KCl, 20 mM Na piruvato, 12,5 mM NaH2PO4 e 5 mM acido ascorbico. Quando è necessario l’ECS contenente 6 mM di glucosio, mescolare 100 mL di brodo con 2 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di 1 M MgCl2, 0,455 mL di acido lattico 13,2 M e 1,08 g di glucosio e riempire con acqua a doppia distillazione fino a 1 L. Se necessario, utilizzare diverse quantità di glucosio per ottenere altre concentrazioni di glucosio. Tampone HEPES con 6 mM di glucosio Preparare 0,5 L di soluzione tamponata con HEPES (HBS) contenente 150 mM naCl, 10 mM HEPES, 6 mM glucosio, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 e 1 mM MgCl2; titolazione a pH = 7,4 con 1 M NaOH.NOTA: se il carbogeno non è disponibile, questo buffer può essere utilizzato per tutti i passaggi anziché ECS. Agarosio (1,9% p/p) Prima della guerra un bagno d’acqua a 40 °C. Aggiungere 0,475 g di agarosio a basso punto di fusione e 25 ml di ECS contenente 6 mM di glucosio in un matraccio Erlenmeyer e mettere il matraccio in un forno a microonde alla massima potenza per alcuni secondi fino a quando non inizia a bollire. Togliere il pallone dal forno e ruotarlo un paio di volte, fino a quando l’agarosio si dissolve completamente. Trasferire il matraccio con l’agarosio liquido nel bagno d’acqua preriscaldato a 40 °C per raffreddare l’agarosio alla temperatura desiderata e mantenerlo liquido fino all’iniezione. Fissare il pallone con un anello di piombo stabilizzante.NOTA: L’agarosio può essere preparato in anticipo e conservato in frigorifero. Prima dell’uso, riscaldare l’agarosio nel forno a microonde fino a quando non si liquefa e trasferire il matraccio Erlenmeyer in un bagno d’acqua preriscaldato a 40 °C. L’agarosio può essere riutilizzato fino a 5x. Se riutilizzato oltre 5x, diventerà denso e più difficile da iniettare. Iniezione di pancreas con agarosioNOTA: Le sezioni 1.2 e 1.3 spiegano la preparazione di fette di tessuto che possono essere utilizzate per diversi scopi sperimentali come l’imaging del calcio, l’elettrofisiologia, l’immunoistochimica, gli studi di secrezione e gli studi strutturali / microanamici.Riempire una siringa da 5 mL con l’agarosio liquido del matraccio Erlenmeyer a bagnomaria dal punto 1.1.3.2, rimuovere eventuali bolle e montare un ago da 30 G. Proteggere l’ago con un cappuccio e tenere la siringa riempita a bagnomaria con l’ago rivolto verso il basso e l’intero volume di agarosio sotto la superficie dell’acqua. Fissare la siringa con un anello di piombo stabilizzante in modo tale che l’anello prema la siringa contro la parete del bagno d’acqua.NOTA: Fare attenzione a non spingere l’agarosio nell’ago poiché si indurirà rapidamente e bloccherà l’ago. Se la temperatura ambiente è bassa e se l’iniezione viene eseguita da una persona meno esperta, aumentare la temperatura del bagno d’acqua fino a 42 °C per guadagnare un po ‘di tempo aggiuntivo per l’iniezione. Riempi un secchiello del ghiaccio con ghiaccio e metti la bottiglia contenente ECS. Bolle l’ECS costantemente a 1,5 ml / min con carbogeno a pressione barometrica e temperatura ambiente per garantire l’ossigenazione e un pH di 7,4. Sacrificare un topo somministrando un’alta concentrazione di CO2 seguita da lussazione cervicale. Fai tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali. Lavorando sotto uno stereomicroscopio, accedere all’addome tramite laparotomia (Figura 2A). Capovolgere delicatamente l’intestino sul lato sinistro del topo (dalla prospettiva anatomica del topo) per esporre il dotto biliare comune. Usa la pinza per sollevare leggermente la parte duodenale e trova la papilla-papilla duodenale maggiore di Vater. Bloccare il dotto biliare comune alla papilla duodenale usando un emostato (Figura 2B,C) per prevenire la fuoriuscita di agarosio dal dotto nel duodeno.NOTA: Per prevenire la fuoriuscita di agarosio nel duodeno e più in alto e in basso nel tratto gastrointestinale, posizionare l’emostato in modo tale che stringa anche il duodeno sia prossimalmente che distalmente dalla papilla. È meglio usare un emostato curvo per questo scopo. Con piccole pinze affilate, raggiungere sotto il dotto biliare comune e rompere la membrana che attacca il dotto al tessuto pancreatico. Per un migliore controllo visivo e un’iniezione più semplice, eliminare il più possibile il grasso e il tessuto connettivo dal condotto. Posizionare il dotto perpendicolarmente su una pinza di grandi dimensioni (Figura 2D) e iniettare l’agarosio liquido preparato nella parte prossimale del dotto biliare comune (Figura 2D). Assicurati di spremere forte la siringa poiché l’agarosio è viscoso. Continuare a riempire il pancreas fino a quando non diventa biancastro e leggermente disteso o per almeno 20-30 s.NOTA: questo è il passaggio più critico nella preparazione delle fette. Se ci sono nodi nell’albero duttale del pancreas, sollevare delicatamente o estrarre il pancreas dalla siringa per livellarli. Non decida quando interrompere l’iniezione in base al volume iniettato dalla siringa poiché il riflusso nel punto di iniezione e la perdita in avanti nel duodeno sono in genere molto più alti del volume iniettato nell’albero duttale del pancreas. È importante sottolineare che le iniezioni di successo possono essere eseguite con cambiamenti praticamente impercettibili nel volume della siringa. Rimuovere la siringa e versare lentamente 20 mL di ECS ghiacciato a bolle a 0-4 °C dal flacone sul pancreas per raffreddare il tessuto e indurire l’agarosio. Estrarre delicatamente il pancreas usando una pinza e forbici sottili e dure. Posizionare il pancreas estratto in una capsula di Petri da 100 mm contenente ~ 40 ml di ECS ghiacciato e spostarlo delicatamente per lavarlo. Trasferire il pancreas in una capsula di Petri fresca da 100 mm contenente ~ 40 ml di ECS ghiacciato. Dalla parte ben iniettata del pancreas, che appare biancastra (Figura 3A), tagliare fino a 6 blocchi di tessuto, di dimensioni 0,1-0,2 cm3 , usando pinze e forbici a taglio duro. Eliminali da qualsiasi tessuto connettivo e adiposo. Riempire una capsula di Petri inferiore non appiccicosa da 35 mm con circa 5 ml di agarosio liquido a 40 °C, trasferire i blocchi di tessuto in essa e mettere immediatamente la capsula di Petri sul ghiaccio per raffreddarla e indurire l’agarosio.NOTA: Il modo in cui i blocchi di pancreas sono intrappolati nell’agarosio determina il modo in cui vengono tagliati durante l’affettamento. Sperimentatori esperti possono provare a mettere a punto la posizione dei blocchi durante i pochi istanti prima che l’agarosi si indurisca quando viene posta sul ghiaccio. Dopo che l’agarosio con i blocchi di tessuto si è indurito, capovolgere la capsula di Petri su una superficie piana liscia come il coperchio di una capsula di Petri da 100 mm e rimuovere l’agarosio tagliando delicatamente con metà di una lama di rasoio nel margine tra la parete laterale della capsula di Petri e l’agarosio. Con una lama di rasoio, tagliare singoli cubetti di agarosio, ciascuno contenente un blocco di tessuto, facendo attenzione che ogni blocco di tessuto sia circondato da agarosio. Incollare i blocchi di agarosio sulla piastra campione del vibratoma con colla cianoacrilata (Figura 3B). Figura 2: Iniezione di agarosio nel dotto biliare comune. (A) Aprire la cavità addominale ed esporre gli organi nella cavità peritoneale. (B) La parte ingrandita dell’area racchiusa dal rettangolo nel pannello A. La macchia bianca sul duodeno (indicata dalla freccia) indica l’ampolla di Vater. Gli isolotti di Langerhans sono indicati da punte di freccia. (C) Bloccare l’ampolla di Vater con un emostato curvo e sollevarlo leggermente per esporre e allungare delicatamente il dotto biliare comune (freccia). (D) Cannulazione del dotto biliare comune e iniezione di soluzione di agarosio all’1,9% utilizzando una siringa da 5 ml e un ago da 30 G. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Affettamento Riempire la camera di taglio del vibratoma con ~ 0,15 L di ECS ghiacciato e bolle costantemente con carbogeno. Circondare la camera di taglio con ghiaccio e aggiungere 2 cubetti di ghiaccio (~ 10 ml ciascuno) in ECS con 6 mM di glucosio nella camera di taglio. Montare la lama del rasoio per il taglio sul vibratoma e fissare a vite la piastra campione con blocchi di agarosio al suo posto. Impostare l’affettatrice per tagliare blocchi di agarosio da 0,05 a 1 mm/s e 70 Hz in fette spesse 140 μm con una superficie di 20-100 mm2. Per le impostazioni dell’affettatrice, seguire le istruzioni del produttore. Subito dopo ogni fase di taglio, mettere in pausa l’affettatrice, raccogliere delicatamente le fette con un pennello fine e trasferirle in una capsula di Petri da 100 mm riempita con 40 ml di tampone HEPES con 6 mM di glucosio a temperatura ambiente (Figura 3C).NOTA: Le fette possono essere conservate nel tampone HEPES a temperatura ambiente per almeno 12 ore e il tampone deve essere sostituito ogni 2 ore. Figura 3: Preparazione e affettamento del tessuto pancreatico. (A) Il pancreas di topo estratto dopo iniezione di agarosio. Il tessuto bianco a sinistra indica una parte ben iniettata (parte duodenale), mentre la parte più rossastra a destra mostra la parte insufficientemente iniettata del pancreas (parte splenica). (B) Taglio del vibratoma di due blocchi di tessuto pancreatico incorporato nell’agarosio. (C) Taglio acuto del tessuto pancreatico con isole di Langerhans indicate da punte di freccia. Barra della scala = 3000 μm. (D) Taglio di tessuto pancreatico acuto al microscopio ottico con l’isolotto di Langerhans indicato da una punta di freccia, l’asterisco indica un dotto pancreatico. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. Saggio vivo/morto con kit di vitalità/citotossicità VIVO/MORTO per cellule di mammifero NOTA: Per alcuni esperimenti, è utile verificare la vitalità delle cellule nelle fette (Figura 4) mediante il saggio vivo/morto come segue. Seguire le istruzioni del produttore per scongelare i flaconcini con i reagenti del kit LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity e preparare soluzioni di lavoro di calceina AM poco prima dell’uso. Usa le soluzioni entro un giorno. In un tubo centrifugo da 15 mL, mescolare 5 μL di 4 mM di calceina AM (Componente A), 20 μL di 2 mM di omodimero di etidio-1 (EthD-1, Componente B) e 10 mL di Soluzione Salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) per preparare una soluzione di lavoro contenente circa 2 μM di calceina AM e 4 μM di EthD-1. Vortice a fondo. Utilizzando un pennello fine, trasferire delicatamente le fette di tessuto in una capsula di Petri da 3 ml con tampone HEPES fresco per diluire l’attività dell’esterasi sierica. Rimuovere il tampone HEPES e coprire le fette con 100-200 μL (o più se necessario) della soluzione di lavoro dal passaggio 2.2. Incubare le fette per 30-45 minuti a temperatura ambiente in una capsula di Petri chiusa. Immagina le fette di tessuto utilizzando filtri di eccitazione/ emissione come raccomandato dal produttore. 3. Carico di colorante di calcio NOTA: i coloranti fluorescenti devono essere protetti dall’esposizione alla luce durante l’intero processo di preparazione e caricamento del colorante, nonché durante la manipolazione delle fette di tessuto colorato. La lamina di stagno può essere utilizzata per coprire tubi o piastre di Petri contenenti il colorante di calcio. Preparazione del colorante Sciogliere il contenuto di un flaconcino (50 μg) del colorante indicatore Ca2+ permeabile alle cellule (eccitazione/emissione 495/523 nm; vedere la tabella dei materiali), 7,5 μL di dimetilsolfossido (DMSO) e 2,5 μL del polassamero (soluzione al 20% in DMSO; Tabella dei materiali) in 6,667 mL di HBS contenente 6 mM di glucosio in un tubo con tappo a vite da 15 mL.NOTA: questa soluzione finale contiene 6 μM del colorante indicatore Ca2+ , 0,11% DMSO e 0,037% polaxamer. Aspirare ed espellere ripetutamente la soluzione nel tubo del tappo a vite con una pipetta per 20 s; immergere il tubo in una camera da bagno ad ultrasuoni per 30 s e vortice per 30 s per migliorare la solubilizzazione. Aliquota 3.333 mL della soluzione finale di colorante indicatore Ca2+ preparata nella fase 3.1.1 in piastre di Petri da 5 mL. Caricamento del colorante Trasferire le fette di tessuto preparate dalla capsula di Petri da 60 ml con HBS in piastre di Petri da 5 ml riempite con la soluzione colorante sollevando delicatamente ogni fetta di tessuto con un pennello sottile e morbido e posizionandola nella soluzione colorante. Incubare fino a 10 fette di tessuto per capsula di Petri. Posizionare la capsula di Petri caricata a fette su uno shaker orbitale a temperatura ambiente impostata sul movimento orbitale a 40 giri al minuto per 50 minuti. Incubare le fette nella soluzione colorante esposta all’aria ambiente a temperatura ambiente, ma schermata dalla luce coprendo la capsula di Petri con carta stagnola. Conservazione delle fette Trasferire le fette di tessuto colorato dalla capsula di Petri da 5 ml in una capsula di Petri da 60 ml riempita con HBS senza coloranti sollevandole delicatamente con un pennello sottile e morbido. Conservare fino a 20 fette per piatto di Petri.NOTA: utilizzare le fette di tessuto per l’imaging a questo punto. Le fette di tessuto manterranno il colorante indicatore Ca2+ per diverse ore. La sopravvivenza delle fette e la ritenzione del colorante possono essere migliorate posizionando la capsula di Petri in un contenitore isolato, circondato da ghiaccio. Ciò è particolarmente importante se le fette caricate con colorante devono essere trasportate. Inoltre, sostituire l’HBS ogni 2 ore. 4. Imaging del calcio Configurazione del microscopio confocale Scegli un ingrandimento oggettivo appropriato a seconda dell’interesse dello studio. Selezionare 20x e 25x (apertura numerica [NA] 0,77-1,00) per visualizzare un intero isolotto, più acini contemporaneamente o condotti più grandi. Seleziona ingrandimenti più alti per studiare la dinamica intracellulare. Scegli la modalità di acquisizione per l’imaging time-lapse (ad esempio, time-lapse, xyt o modalità simile). Impostare il foro stenopeico su 100-200 μm. Impostare il percorso luminoso per i fluorofori verdi: eccitazione a 488 nm e raccolta di emissione a 500-700 nm. Selezionare preferibilmente rivelatori con un’elevata efficienza quantistica (ad esempio, fosfuro di arseniuro di gallio) rispetto ai rivelatori fotomoltiplicatori. Configurazione della camera di registrazione e del sistema di perifusione Montare la camera di registrazione sullo stadio a temperatura controllata del microscopio e del sistema di perifusione (configurazione alimentata a gravità o basata su pompa peristaltica, volume 1 mL). Posizionare l’ingresso e l’uscita sui bordi più lontani della camera di registrazione per evitare meandri del perfusato all’interno della camera e impostare l’afflusso e il deflusso su valori uguali (1-2 ml / min). Evitare la deriva dell’altezza del menisco liquido e delle goccioline nel perifusato. Impostare il controllo della temperatura del sistema di perifusione a 37 °C.Avviare la perifusione con la soluzione non stimolante e preparare le soluzioni stimolanti. Cambiare le soluzioni tramite valvole motorizzate o commutando manualmente le soluzioni che alimentano il sistema di perifusione. Registra la dinamica del calcio Trasferire una singola fetta di tessuto nella camera di registrazione. Immobilizzare la fetta di tessuto con un peso in platino a forma di U con rete di nylon tesa (ad esempio, da calze di nylon). Evitare di posizionare fili di nylon sulla struttura di interesse. Individuare un isolotto/acino/condotto utilizzando l’opzione brightfield. Esegui l’imaging dal vivo per posizionare le strutture studiate nel campo visivo e imposta i parametri di imaging. Ottimizza il rapporto segnale-rumore regolando la potenza del laser, l’amplificazione del rilevatore e la media/binning della linea per consentire la visualizzazione delle celle mantenendo la potenza del laser al minimo. Regolare il piano focale della registrazione a ~15 μm sotto la superficie di taglio (Figura 5) per evitare la registrazione da celle potenzialmente danneggiate sulla superficie di taglio. Acquisisci immagini. Impostare la frequenza di campionamento su 1-2 Hz per rilevare inizialmente le singole oscillazioni e utilizzare uno scanner risonante in grado di eseguire una media di linea veloce (8-20) a una velocità di acquisizione più elevata (>10 Hz) per registrare l’attività intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]IC). Consentire un intervallo (ad esempio, il 30% del tempo totale di campionamento) tra le illuminazioni puntuali consecutive per evitare la fototossicità. Registrare un’immagine ad alta risoluzione (ad esempio, 1024 x 1024 pixel, con una media di linea > 50) prima dell’acquisizione di serie temporali (vedere la sezione 5).NOTA: la frequenza di campionamento di 1-2 Hz è inferiore al criterio di Nyquist per la frequenza di acquisizione per la maggior parte delle celle e la forma del segnale sarà sottocampionata per impostazione predefinita. Fare riferimento a un grafico online, se disponibile nel software di imaging, per ottenere un feedback immediato sulla risposta di preparazione, sulla sovrailluminazione, sul fotosbiancamento e sulla deriva meccanica. In caso di un alto tasso di sbiancamento durante l’acquisizione, interrompere la registrazione e diminuire la potenza del laser aumentando il guadagno del rilevatore per mantenere il rapporto segnale-rumore. In caso di deriva meccanica, verificare la tensione tra tubi/cavi e lo stadio del microscopio, nonché perdite di liquido o variazioni di volume nella camera di registrazione. Facoltativamente, tentare di correggere manualmente la deriva durante l’acquisizione; tuttavia, si noti che ciò produrrà intrinsecamente risultati limitati.NOTA: Le cellule endocrine sono altamente eterogenee a concentrazioni vicine alla soglia. È necessaria una durata sufficiente della stimolazione per rilevare la gamma di ritardi di attivazione/ disattivazione nelle singole cellule. Ciò è particolarmente importante per il rilevamento accurato delle off-response seguendo protocolli altamente stimolanti. Utilizzare l’imaging del calcio per discriminare funzionalmente tra cellule endo- ed esocrine (Figura 6). Per registrare l’attività transitoria durante l’attivazione e la disattivazione, applicare stimoli senza interrompere la registrazione. Salvare i dati dopo la fine della sperimentazione (prendere in considerazione l’utilizzo di una funzione di salvataggio automatico). Consentire un periodo di raffreddamento prima di spegnere l’alimentazione del laser in modo da non danneggiare i laser durante la procedura di spegnimento. 5. Analisi dei dati Ispeziona visivamente la registrazione qualitativamente riproducendo il video time-lapse. Verificare la presenza di derive di cella dal campo visivo o dal piano ottico. Se si è verificata una deriva all’interno del piano ottico, utilizzare il plug-in di correzione della deriva in ImageJ. Selezionare le regioni di interesse (ROI) utilizzando software per microscopi o software di terze parti. Utilizzare l’immagine ad alta risoluzione, la proiezione massima o la media fotogrammi come riferimento per selezionare i ROI. Riprodurre l’immagine time-lapse per visualizzare le celle che rispondono che non sono visibili nelle immagini di riferimento. Posizionare i ROI in modo tale che l’area selezionata di un ROI non si sovrapponga alle celle vicine per evitare la diafonia del segnale tra i ROI. Esporta i dati delle serie temporali come valore medio roi per fotogramma. Esporta le coordinate del ROI. Correggere i dati delle serie temporali per lo sbiancamento (Figura 7A) utilizzando una combinazione di un adattamento esponenziale e lineare, come descritto da(1)dove x(t) indica il segnale di fluorescenza in un punto temporale t; xcorr(t) il segnale corretto nei punti temporali corrispondenti; e a, b e c i parametri dell’adattamento calcolati come la somma minima di quadrati tra corr(t) e x(t). Analizzare la fase di attivazione e disattivazione della risposta (Figura 7B). Calcola la derivata prima dei dati delle serie temporali e determina lo zenit e il nadir della derivata corrispondenti rispettivamente all’attivazione e alla disattivazione. In alternativa, selezionare manualmente l’inizio dell’aumento fasico. Salvare ed esportare i tempi di attivazione/disattivazione e le coordinate delle celle corrispondenti. Analizzare la fase di plateau (Figura 7C). Rileva le singole oscillazioni sogliendo i dati grezzi o sogliendo la derivata prima dei dati delle serie temporali. Definire l’inizio e la fine di una singola oscillazione come il tempo corrispondente alla mezza ampiezza dell’oscillazione. Calcola la durata e la frequenza delle singole oscillazioni per ogni cella. Calcola il valore inverso dell’intervallo interspike (adatto per modelli di attività regolari). In alternativa, dividere il numero di oscillazioni per l’intervallo di tempo del record (adatto per modelli di attività irregolari). Calcola il tempo attivo. Esprimere il tempo attivo come somma delle durate e dividere questo valore per l’intervallo di tempo. In alternativa, moltiplicare la frequenza e la durata che corrispondono a un’oscillazione.NOTA: dividendo la somma delle durate per l’intervallo di tempo si ottengono risultati solidi, ma si ottiene una bassa discriminazione statistica in quanto si ottiene un singolo punto dati per cella. Moltiplicando la frequenza e la durata di un’oscillazione si ottiene una risoluzione temporale oscillazione-oscillazione.

Representative Results

L’iniezione della soluzione di agarosio nel dotto pancreatico è la fase più critica nella preparazione della fetta di tessuto pancreatico. Un’iniezione riuscita può essere riconosciuta da uno sbiancamento del tessuto pancreatico, come si vede sul lato sinistro della Figura 3A, mentre una parte del pancreas iniettata in modo incompleto è presentata sul lato destro della Figura 3A. Le isole di Langerhans possono essere riconosciute ad occhio nudo o sotto uno stereomicroscopio, e questo aiuta a tagliare le parti appropriate del pancreas per il successivo incorporamento in blocchi di agarosio (Figura 3B). In una fetta di tessuto pancreatico di topo appena tagliata, le isole di Langerhans possono essere facilmente distinte dal tessuto esocrino circostante e dal mesenchima come macchie bianche sotto lo stereomicroscopio (Figura 3C) o come strutture brunastre al microscopio ottico (Figura 3D). Le fette di tessuto pancreatico possono essere utilizzate per diversi tipi di esperimenti per almeno 12 ore dopo l’affettamento. Oltre alla valutazione morfologica grossolana sotto lo stereomicroscopio, il microscopio ottico e le risposte funzionali delle cellule durante l’imaging del calcio, è possibile valutare la vitalità delle fette di tessuto pancreatico (Figura 4). Figura 4: Vitalità delle cellule all’interno della fetta di tessuto. La vitalità delle cellule è stata determinata con il test Live/Dead. Le cellule vive sono colorate da Calcein AM (mostrato in verde), mentre le cellule morte sono colorate con ethidium homodimer-1 (mostrato in rosso). Le linee gialle indicano la posizione della sezione trasversale X-Y dello stack Z visualizzata in basso e a destra. La profondità completa dello Z-stack è di 88 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Per gli esperimenti di imaging del calcio, l’indicatore fluorescente del calcio deve penetrare attraverso alcuni strati di cellule. La Figura 5A presenta il successo del carico del colorante indicatore Ca2+ permeabile alle cellule nella fetta di tessuto pancreatico in cui possono essere riconosciute le singole isole e le cellule acinari. Al contrario, le fette nella Figura 5B-D non sono ottimali a causa della penetrazione infruttuosa del colorante (Figura 5B), della mancanza di cellule insulari (Figura 5C) e di molto tessuto necrotico sulla superficie (Figura 5D). Tali fette possono essere scartate, controllate per la presenza di isole aggiuntive che vengono tagliate o macchiate meglio (vedere la Tabella 1 per la risoluzione dei problemi) o utilizzate per registrare le risposte delle cellule esocrine. Figura 5: Esempi di preparati utilizzabili e inutilizzabili. (A) Un esempio di preparazione riuscita della fetta di tessuto pancreatico con cellule ben macchiate nelle isole di Langerhans, nonché cellule duttali e tessuto acinare circostante. (B) Un esempio di fetta di tessuto scarsamente macchiata. (C) Esempio di isolotto di Langerhans con discontinuità strutturali. (D) Un esempio di un isolotto di Langerhans contenente molte cellule morte e molti detriti. La tabella di ricerca “glow-over, glow-under” sulla destra visualizza l’intensità 0 in verde e la saturazione in blu. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. I risultati rappresentativi dell’imaging del calcio utilizzando il colorante indicatore Ca2+ permeabile alle cellule sono mostrati nella Figura 6. Nella Figura 6A, viene presentata un’immagine ad alta risoluzione di una fetta di tessuto pancreatico, contenente un’isolotto di Langerhans, tessuto acinare e un dotto pancreatico. Per una migliore distinzione, la parte endocrina, esocrina e duttale della fetta di tessuto pancreatico presentata nella Figura 6A sono colorate nella Figura 6B. L’uso di stimoli appropriati può discriminare funzionalmente tra diverse cellule insulari o cellule insulari e non insulari51. Le cellule beta risponderanno tipicamente a una stimolazione a impulsi quadrati da parte del glucosio con un aumento transitorio di [Ca2+]IC seguito da oscillazioni veloci del calcio su un plateau sostenuto (Figura 6C, pannello superiore). Poiché tutte le cellule beta sono accoppiate in un unico, grande, sincizio funzionale, queste oscillazioni sono anche molto ben sincronizzate tra le diverse cellule mediante la diffusione di [Ca2+]IC onde 32,34,52,53,54 (Figura 7C). Le oscillazioni [Ca2+]IC più lente con un periodo di 5-15 minuti possono essere alla base delle oscillazioni veloci o addirittura essere il tipo predominante di risposta55,56. Lo stesso semplice protocollo può rivelare altri tipi di risposte, specialmente alla periferia delle isole (Figura 6C, pannello inferiore). Poiché queste cellule non sono sincronizzate con le cellule beta e rispondono con oscillazioni più veloci e irregolari che sono già presenti in condizioni di basso glucosio o con una diminuzione dell’attività, tali risposte sono altamente suggestive delle cellule non beta 21,32,57,58. Tuttavia, la loro caratterizzazione funzionale definitiva richiede protocolli più complessi con ulteriori passaggi di stimolazione o approcci alternativi, che sono discussi di seguito. Le risposte tipiche delle cellule acinari e duttali sono presentate rispettivamente nella Figura 6D e nella Figura 6E. Fare riferimento alla letteratura per maggiori dettagli sulle cellule acinari e duttali 22,23,35. Figura 6: Risultati rappresentativi della dinamica del calcio in diversi tipi di cellule pancreatiche. (A) Un’immagine ad alta risoluzione di un’isolotto di Langerhans con tessuto circostante. Barra della scala = 100 μm. (B) Delineazione di parti distinte del tessuto pancreatico con tessuto acinare mostrato in giallo, un isolotto di Langerhans mostrato in rosso e un segmento dell’albero duttale in blu. Scala bar = 100 μm. (C) Tracce tipiche di dinamica del calcio in cellule beta e putative non beta durante la stimolazione con 12 mM di glucosio; 3 mM di glucosio è stato utilizzato per condizioni non stimolanti. I protocolli che possono essere utilizzati per una discriminazione più specifica delle cellule non beta sono descritti nella sezione di discussione. (D) Una traccia tipica della dinamica del calcio delle cellule acinari stimolate da 25 nM acetilcolina. (E) Una traccia tipica della dinamica del calcio delle cellule duttali stimolate da 1 mM di acido chenodesossicolico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Dopo il successo dell’imaging del calcio, i dati vengono prima esportati e corretti per lo sbiancamento da una combinazione di un adattamento esponenziale e lineare, come descritto nella sezione del protocollo. Una serie temporale prima e dopo la correzione dello sbiancamento è presentata nella Figura 7A. Successivamente, è possibile analizzare diversi parametri nella fase di attivazione e disattivazione della risposta e nella fase di plateau. Un ritardo nell’insorgenza dell’aumento di [Ca2+]IC dopo la stimolazione può essere misurato come rappresentato dal ritardoA nella Figura 7B e dall’eterogeneità dei ritardi tra le singole cellule (ritardoA1). Gli stessi parametri (ritardoD e ritardoD1) possono essere utilizzati per descrivere la fase di disattivazione. Dopo l’iniziale aumento transitorio [Ca2+]IC, la fase di plateau nella maggior parte delle cellule beta pancreatiche in un’isoletta è caratterizzata da oscillazioni IC ad alta frequenza relativamente regolari [Ca2+]. La fase di plateau può essere descritta analizzando i parametri funzionali classici. La presentazione schematica delle oscillazioni [Ca2+]IC durata, frequenza e percentuale di tempo attivo sono presentate nella Figura 7C. Nell’imaging del calcio con velocità di acquisizione superiori a 10 Hz, le onde di calcio che si diffondono ripetutamente attraverso l’isolotto possono anche essere riconosciute chiaramente (Figura 7C). Figura 7: Analisi dei dati delle serie temporali. (A) Correzione dei dati delle serie temporali per il fotosbiancamento. (B) Analisi dei ritardi nell’attivazione dopo stimolazione e nella disattivazione dopo la cessazione della stimolazione con 12 mM di glucosio. La durata della stimolazione è indicata dalla barra grigia chiara e ombreggiata nell’immagine. (C) Analisi di diversi parametri della fase di plateau: I) Durata dell’oscillazione determinata a mezza altezza, II) frequenza delle oscillazioni determinata da intervalli di inter-oscillazione. III) tempo attivo come prodotto della frequenza e della durata delle oscillazioni. I-IV) Ritardi tra oscillazioni in una data onda di oscillazioni che si diffondono attraverso l’isolotto di Langerhans determinati dai ritardi (Δt) nel tempo in cui una singola cella raggiunge la mezza altezza dell’oscillazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Il metodo della slice del tessuto pancreatico è un metodo sperimentale veloce per studiare la morfologia e la fisiologia delle parti endocrine ed esocrine del pancreas in una preparazione più conservata, in situ. Molti dei vantaggi sono già stati evidenziati nell’Introduzione. Vale la pena sottolineare che in generale (cioè non solo per l’imaging del calcio), l’approccio slice per studiare la fisiologia pancreatica consente di risparmiare tempo perché non comporta un periodo di recupero dopo l’isolamento. Quest’ultimo non è assolutamente necessario con tutti i tipi di esperimenti e usi di isolotti isolati di specie diverse, ma è tipicamente impiegato per aumentare la purezza, ripristinare la vitalità e la funzionalità, e talvolta per raccogliere isolotti da diversi donatori 59,60,61,62,63,64 . Tuttavia, nel contesto dell’imaging del calcio, è stato scoperto che le risposte delle cellule beta dipendono dalla durata e dalle condizioni della coltura, e questa è un’importante fonte di variazione che dovrebbe essere presa in considerazione quando si utilizzano isole isolate15,65. Lo stesso problema dovrebbe essere considerato per le fette di tessuto se la loro coltura a lungo termine diventa un’opzione ampiamente utilizzata in futuro22,36. Il metodo della fetta di tessuto ha anche un alto rendimento e quindi potenzialmente riduce la sofferenza degli animali e aumenta il potere statistico. Inoltre, poiché molte fette possono essere preparate da un singolo animale e poiché le fette sopravvivono per lunghi periodi, includendo lo stesso animale o anche lo stesso isolotto sia nel gruppo sperimentale che in quello di controllo diventa fattibile.

Poiché l’architettura originale e le comunicazioni cellula-cellula sono preservate, e poiché è compatibile con una serie di analisi strutturali, metodi elettrofisiologici, di imaging e saggi di secrezione ormonale, questo metodo è particolarmente utile per studiare le funzioni pancreatiche che dipendono da interazioni indisturbate tra singole cellule, ad esempio sensibilità a secretagoghi, interazioni paracrine e immunitarie tra diversi tipi di cellule, modelli di attività elettrica, proprietà della dinamica del calcio e secrezione di diversi ormoni. Per l’imaging del calcio in particolare, i principali vantaggi dell’utilizzo delle fette sono l’esposizione del nucleo dell’isolotto e la possibilità di acquisire segnali da molti tipi di cellule diverse con alta risoluzione. A seconda delle esigenze dell’esperimento e dell’età degli animali, lo spessore può essere variato, le fette possono essere trasfettate o ottenute da animali con reporter geneticamente codificati. Come spiegato più dettagliatamente di seguito, gli ultimi due approcci consentono anche l’identificazione funzionale specifica e la caratterizzazione delle risposte da cellule non beta 31,66. Inoltre, le isole provenienti da parti ben definite dell’organo possono essere studiate per differenze di reattività o suscettibilità alle malattie. Sebbene non richiedano un periodo di incubazione di recupero, possono essere facilmente incubati con diversi agenti farmacologici, acidi grassi, glucosio alto e citochine.

Ancora più importante, poiché l’alta risoluzione è raggiungibile in combinazione con la risoluzione a singola cellula o addirittura subcellulare, l’imaging confocale del calcio a fette è uno dei metodi più adatti per analizzare le onde di calcio, la connettività funzionale e i diversi ruoli funzionali delle cellule in parti distinte diun’isoletta 54,67. Nonostante una serie di vantaggi, l’approccio della fetta di tessuto presenta importanti limitazioni. In primo luogo, è ancora almeno in parte dirompente per l’architettura isolotta ed esocrina, specialmente sulla superficie di taglio, e precauzioni, come bassa temperatura, frequente scambio di soluzioni e manipolazione delicata e rapida, sono necessarie durante la preparazione per prevenire ulteriori danni enzimatici meccanici ed endogeni. In secondo luogo, i modelli di somministrazione di nutrienti e secretagoghi sono ancora inferiori alla via in vivo, la preparazione è staccata dall’innervazione sistemica e il feedback inter-organo, come tra l’isolotto e i suoi tessuti bersaglio, è impossibile, a differenza degli approcci in vivo. In terzo luogo, lo spessore massimo della fetta è limitato dall’ossigenazione, dall’apporto di nutrienti e dalla regolazione del pH a ~ 200 μm9. Inoltre, sia la preparazione delle fette che l’imaging richiedono molta formazione, e analisi approfondite dei dati sul calcio da lunghe serie temporali e da molte cellule richiedono conoscenze specialistiche che spesso non sono incluse nel toolkit di un fisiologo classico e richiedono l’aiuto di fisici o data scientist. Il vantaggio che le interazioni omo- ed eterotipiche sono preservate può anche complicare l’analisi dei campioni a causa della presenza di segnali provenienti da altre cellule nelle regioni di interesse. A seconda dei protocolli, l’attivazione di altre cellule può portare a una stimolazione aggiuntiva indiretta o all’inibizione di una cellula osservata.

Questo può essere risolto in modo conclusivo solo con approcci di deconvoluzione, con protocolli di stimolazione più complessi che includono sostanze che bloccano alcuni degli effetti indiretti, utilizzando specifici animali knock-out e con un attento confronto dei risultati con i risultati di altri studi che impiegano metodologie più riduzioniste. Inoltre, se sono necessarie misurazioni della secrezione, va tenuto presente che alcune fette possono mancare di isole e la massa totale di tessuto endocrino in una singola fetta è in genere bassa. La preparazione di fette di tessuto pancreatico acuto per l’imaging comporta diversi passaggi critici discussi nelle sezioni seguenti e riassunti nella Tabella 1, dove il lettore può anche trovare brevi, ma importanti suggerimenti per la risoluzione dei problemi. In primo luogo, quando si prepara la soluzione di agarosio, la polvere di agarosio deve dissolversi completamente, altrimenti le particelle non disciolte potrebbero ostruire l’iniezione. Mantenere la soluzione omogenea di agarosio a 37-45 °C per evitare l’indurimento dell’agarosio a causa di una temperatura troppo bassa da un lato e per prevenire danni ai tessuti dovuti a temperature troppo elevate dall’altro. Dopo l’uso, l’agarosio rimanente può essere conservato a 4 °C e riscaldato, anche se il riscaldamento ripetuto può comportare un aumento della densità a causa dell’evaporazione dell’acqua, rendendo infine l’iniezione difficile o impossibile.

Il prossimo passo critico nella preparazione è bloccare correttamente la papilla duodenale maggiore. Una macchia bianca sul duodeno indica la giunzione del dotto biliare comune e del duodeno. Un morsetto posto troppo prossimalmente comporterà l’ostruzione di alcuni rami pancreatici laterali del dotto comune, disabilitando l’iniezione di queste parti, mentre un morsetto posto troppo distalmente comporterà la fuoriuscita di agarosio attraverso il percorso di resistenza inferiore direttamente nel duodeno. Prima della cannulazione del dotto biliare comune, il tessuto adiposo circostante può essere accuratamente rimosso per una migliore visualizzazione del dotto e un maggiore controllo durante l’iniezione. Una precisione insufficiente durante la rimozione del tessuto circostante può causare la perforazione del condotto. Anche la selezione del diametro dell’ago utilizzato per l’iniezione di agarosio è importante. Nei topi, viene preferibilmente utilizzato un ago da 30 G; aghi più piccoli (32 o 33 G) richiedono uno sforzo maggiore a causa dell’elevata viscosità della soluzione di agarosio e sono più inclini all’ostruzione. Tuttavia, se usati in combinazione con una soluzione di agarosio a bassa densità, possono essere molto utili in ceppi di topo più piccoli e animali più giovani. Durante i primi giorni postnatali, l’agarosio può essere iniettato in alternativa in modo subcapsulare piuttosto che per via intraduttale2. L’uso di aghi con diametro maggiore nei topi molto probabilmente comporterà il danneggiamento del dotto biliare comune. Questo può accadere anche con il diametro corretto dell’ago e una pinza può aiutare a mantenere l’ago in posizione durante l’iniezione. Aghi di diametro maggiore possono essere l’unica soluzione in caso di condotti più grandi, come si trova nei ratti. Se l’ago è troppo stretto per garantire una tenuta ermetica che impedisca la retroperditura, una legatura può essere posizionata attorno ad esso al momento dell’ingresso riuscito nel condotto.

L’iniezione di agarosio richiede un certo sforzo a causa della viscosità della soluzione e, una volta iniziato il processo di iniezione, non deve essere interrotta poiché la soluzione di agarosio a basso punto di fusione può solidificarsi nell’ago o nelle parti più grandi dell’albero duttale prima che l’iniezione sia completata. Ciò si tradurrà in una scarsa penetrazione dei tessuti e in un peggior supporto durante il taglio. Il dotto deve essere sempre cannulato nel punto in cui il dotto epatico sinistro e il dotto cistico si uniscono per formare il dotto biliare comune. Se il dotto biliare comune viene perforato, provare ripetutamente a cannulare più vicino al duodeno. Quando il pancreas è sufficientemente stabilizzato con una soluzione di agarosio ed estratto dalla cavità peritoneale, vengono tagliati piccoli pezzi di tessuto ben iniettato. Prima di incorporarli nell’agarosio, è fondamentale rimuovere tutti i tessuti adiposi e connettivi poiché i loro residui rendono più difficile l’affettamento. Lo stesso vale per i vasi sanguigni e i residui dei dotti, tranne quando sono al centro dell’esperimento. In questo caso, assicurati di posizionarli in modo tale da ottenere la sezione trasversale desiderata. Quando si incorpora il tessuto in agarosio, assicurarsi che la temperatura sia appropriata (37 °C) e che il tessuto sia completamente circondato da agarosio, poiché le forze durante l’affettamento del vibratoma possono strappare il tessuto pancreatico dai blocchi di agarosio.

Asciugare rapidamente i blocchi di tessuto prima di metterli in agarosio posizionandoli brevemente su un fazzoletto di carta può aiutare a prevenire uno scarso contatto tra tessuto e agarosio durante questa fase. Durante la solidificazione dei blocchi di agarosio, posizionare la capsula di Petri orizzontalmente e impedire il contatto tra il tessuto pancreatico e il fondo della capsula di Petri. Se il pancreas non viene completamente iniettato, il processo di taglio sarà impegnativo. Pertanto, cerca di ridurre la velocità di taglio per ottenere fette di tessuto. Per ridurre al minimo il danno cellulare durante l’affettamento del vibratoma, sostituire regolarmente l’ECS (e i cubetti di ghiaccio fatti di ECS) nella camera di affettamento. Quest’ultimo ridurrà l’attività degli enzimi pancreatici rilasciati dal tessuto acinare durante l’affettamento. Anche lo spessore delle fette è di cruciale importanza. Per la dinamica del calcio e gli esperimenti elettrofisiologici, le fette da 140 μm vengono solitamente tagliate; tuttavia, secondo lo scopo dello studio, lo spessore della fetta può variare da 90 μm a 200 μm. Tieni presente che nelle fette più spesse, la diffusione di ossigeno e sostanze nutritive sarà limitata, ma includeranno più tessuti. Inoltre, ci si può aspettare che la proporzione di isole non tagliate aumenti con l’aumentare dello spessore della fetta. Le fette possono essere conservate in un ECS regolarmente scambiato a temperatura ambiente per diverse ore o anche coltivate in un mezzo cellulare appropriato per diversi giorni; tuttavia, questo può eventualmente influenzare la normale fisiologia delle cellule insulari 3,22.

Quando si prepara la soluzione colorante, assicurarsi un’attenta miscelazione di tutti i componenti ed evitare l’esposizione alla luce ambientale. La fetta pancreatica è composta da molti strati cellulari e l’assorbimento del colorante di calcio è limitato ai primi strati cellulari più superficiali, come descritto in precedenza per le isole isolate58,68 e le fette ipofisarie69. Tuttavia, a differenza delle isole isolate in cui la capsula circostante e gli strati cellulari esterni ostacolano la penetrazione del colorante negli strati più profondi, le fette di tessuto consentono l’accesso all’intera superficie della sezione trasversale dell’isolotto, consentendo la misurazione simultanea della dinamica del calcio in centinaia di cellule da tutti gli strati di un’isolotto. Gli indicatori fluorescenti Ca2+ sono i più utilizzati per misurare la dinamica del calcio e, insieme a CLSM, consentono registrazioni con alta risoluzione temporale, raggiungendo diverse centinaia di Hertz. Quando si seleziona l’indicatore fluorescente Ca2+ più appropriato, considerare diversi fattori, tra cui la forma dell’indicatore, che influenza il metodo di carico della cella, la modalità di misurazione (qualitativa o quantitativa) e la costante di dissociazione (Kd) che deve essere nell’intervallo di concentrazione di Ca2+ di interesse e dipende da pH, temperatura, presenza di Mg2+ e altri ioni, così come il legame proteico. Poiché i segnali cellulari Ca2+ sono solitamente transitori, dovrebbe essere considerata anche la costante del tasso di legame Ca2+. Per misurare la dinamica [Ca2+]IC nelle cellule pancreatiche, questo gruppo utilizza principalmente il colorante indicatore Ca2+ permeabile alle cellule descritto in questo protocollo (Tabella dei materiali) in quanto è un indicatore a lunghezza d’onda lunga con le lunghezze d’onda di emissione nello spettro in cui l’autofluorescenza cellulare è solitamente meno problematica e l’energia della luce di eccitazione è bassa, il che riduce il potenziale di fotodanneggiamento cellulare. Poiché questo colorante è fluorescente a basse concentrazioni di Ca2+, questo facilita la determinazione del basale [Ca2+]IC e aumenta la visibilità cellulare prima della stimolazione. Dopo aver legato Ca2+, l’intensità di fluorescenza del colorante aumenta di 14 volte, consentendo il rilevamento di cambiamenti anche lievi in [Ca2+]IC.

Per il successo dell’imaging del calcio a cellule vive, è necessario considerare diversi parametri hardware cruciali, come descritto nella sezione del protocollo. Per l’imaging di cellule vive in cui le ampiezze del segnale sono basse e le probabilità di fototossicità sono elevate, gli obiettivi con un NA più alto vengono preferibilmente utilizzati per raccogliere più luce dal campione. Se la dinamica del calcio deve essere registrata con un’alta risoluzione temporale, utilizzare lo scanner risonante anziché i galvanometri lineari. Oltre a scegliere l’obiettivo giusto, l’uso di rivelatori altamente sensibili, come i rilevatori ibridi che richiedono meno potenza laser, evita la fototossicità e il fotosbiancamento. Questo è di particolare importanza per l’imaging del calcio di lunga durata. Altri passaggi importanti nell’imaging del calcio sono le impostazioni dei parametri della qualità dell’immagine per le acquisizioni di serie temporali. I più importanti sono la risoluzione temporale e spaziale. Poiché la dinamica del calcio di per sé determina la risoluzione temporale accettabile più bassa, la frequenza di campionamento deve essere almeno due volte superiore alla frequenza del segnale prevista per rilevare il segnale o anche 10 volte superiore per rilevare la forma del segnale in modo affidabile. Nelle fette di tessuto pancreatico acuto, la dinamica del calcio può essere misurata in centinaia di cellule contemporaneamente e, quindi, anche la risoluzione spaziale è importante. Questo può essere migliorato aumentando il numero di pixel o aumentando la media della linea durante l’acquisizione dal vivo. Tuttavia, a causa della relazione inversa tra la risoluzione spaziale e quella temporale, è necessario un compromesso tra le due impostazioni.

Se l’imaging del calcio deve essere eseguito in una specifica popolazione cellulare all’interno del pancreas, è necessario uno stimolo in grado di differenziare funzionalmente le cellule all’interno della fetta. L’alto glucosio attiva in modo affidabile e rapido le cellule beta a un modello oscillatorio che si sovrappone a un livello elevato di calcio ed è altamente sincronizzato tra tutte le cellule all’interno di un’isolotto 32,58,70. Le cellule beta sono il tipo di cellula più numeroso all’interno di un isolotto e si trovano principalmente nel nucleo dell’isolotto nei topi. Lo stesso protocollo di stimolazione diminuisce e talvolta non cambia sensibilmente lo scoppio nelle cellule alfa 30,32,58,70,71,72. Per discriminare funzionalmente le cellule alfa, è possibile utilizzare glucosio basso (3 mM), glutammato o adrenalina per aumentare la loro frequenza o basale [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. Rappresentano il 10-20% delle cellule insulari e saranno rilevati alla periferia dell’isolotto1. Le cellule Delta si trovano anche alla periferia. Costituiscono solo ~ 5% del numero totale di cellule endocrine in un’isoletta e sono tipicamente attivi in 6 mM di glucosio e rispondono alla stimolazione del glucosio con una maggiore attività di scoppio irregolare dal basale o un livello di calcio leggermente elevato 1,32,71,76. La grelina può essere utilizzata per la stimolazione specifica delle cellule delta 21,77,78,79 in esperimenti di imaging del calcio. Tuttavia, i protocolli per l’identificazione funzionale specifica delle cellule PP ed epsilon rimangono da definire. Inoltre, 25 nM acetilcolina attiva in modo affidabile le cellule acinari in attività di scoppio 35,80,81. Inoltre, un certo numero di altri secretagoghi, come ceruleina, colecistochinina e carbamilcolina, possono essere utilizzati per evocare risposte di calcio nelle cellule acinari 22,40,82,83.

Infine, 1 mM di acido chenodesossicolico evoca in modo affidabile le risposte del calcio nelle cellule duttali nelle fette di tessuto; angiotensina II, ATP e alcuni altri secretagoghi possono anche essere usati 11,23,84,85. Ogniqualvolta un’identificazione funzionale basata su risposte caratteristiche a specifici secretagoghi e inibitori non è sufficiente, per l’identificazione di diversi tipi cellulari 9,22,71,71,86 può essere impiegata un’identificazione di diversi tipi di cellule 9,22,71,86 . Negli ultimi due anni, il metodo della fetta di tessuto è stato adattato con successo al tessuto umano, aprendo molte nuove importanti strade di ricerca sia nell’esocrino41 che nella fisiologia endocrina 9,36,37,39. È interessante notare che una valutazione dettagliata della dinamica del calcio nelle isole umane è stata notoriamente difficile e rimane da indagare in modo più dettagliato87. Combinato con la microscopia confocale avanzata, il metodo della fetta di tessuto pancreatico ha permesso molte nuove intuizioni sulla dinamica del calcio nei topi e si spera che faccia lo stesso per il tessuto umano.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro presentato in questo studio è stato sostenuto finanziariamente dall’Agenzia slovena per la ricerca (finanziamenti di base per la ricerca. P3-0396 e I0-0029, nonché progetti di ricerca n. J3-9289, N3-0048 e N3-0133) e dal Fondo austriaco per la scienza / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (sovvenzioni bilaterali I3562–B27 e I4319–B30). Ringraziamo Maruša Rošer, Maša Čater e Rudi Mlakar per l’eccellente assistenza tecnica.

Materials

Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 – Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors – ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS – 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate – CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate – MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride – KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate – NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride – NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide – NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project
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Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).
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