경두개 기능 적 초음파 이미징을 사용하여 마우스의 전신 뇌 3D 활성화 및 기능 적 연결 매핑
Summary
이 프로토콜은 기능성 초음파 (fUS)를 사용하여 마우스 뇌의 체적 뇌 혈역학 적 변이의 정량화를 설명합니다. 감각 자극에 따른 3D 기능 활성화 맵및 휴식 상태 기능적 연결에 대한 절차는 마취 및 깨어 있는 마우스에서 예시적인 예로 제공됩니다.
Abstract
기능성 초음파 (fUS) 이미징은 초고속 도플러 혈관 조영술에 의해 달성 된 대뇌 혈액 볼륨의 고감도 측정에 의존하는 새로운 뇌 이미징 양식입니다. 뇌 관류가 로컬 뉴런 활동에 강하게 연결됨에 따라,이 기술은 작업 유도 지역 활성화의 전체 뇌 3D 매핑뿐만 아니라 휴식 상태 기능 적 연결, 비 침습적, 타의 추종을 불허하는 spatio-측두측 해상도 및 운영 단순성을 허용합니다. fMRI (기능적인 자기 공명 화상 진찰)와 비교하여, fUS 화상 진찰의 주요 이점은 깨어 있고 행동하는 동물 실험과 완전한 호환성을 가능하게 하는 것입니다. 더욱이, 신경 과학에서 가장 많이 사용되는 전임상 모델인 마우스에서 fMRI 뇌 매핑은 뇌의 작은 크기와 안정적인 생리적 상태를 유지하는 데 어려움으로 인해 기술적으로 여전히 어려운 상태로 남아 있습니다. 여기서 우리는 전동 선형 트랜스듀서가 있는 기성 상용 fUS 시스템을 사용하여 마취 및 깨어 있는 마우스에서 전뇌 fUS 이미징을 위한 간단하고 신뢰할 수 있고 견고한 프로토콜을 제시하며, 감각 자극에 따라 상당한 피질 활성화를 산출하고 네트워크 식별을 위한 재현 가능한 3D 기능 적 연결 패턴을 제공합니다.
Introduction
지난 2년 동안, 신경 이미징은 뇌 기능과 조직을 연구하는 중요한 도구가 되어 연구자들이 신경과학 분야에서 중요한 발견을 할 수 있게 해 주었으며, 이를 가능하게 했습니다. 오늘날 기능성 자기 공명 영상(fMRI)은 작업 또는 약물 유발 뇌 활성화를 평가하고 기능적 연결을 매핑하는 금 표준 임상 신경 이미징 기술이 되었습니다. 인간 fMRI는 높은 신뢰성과 감성을 가지고 있지만, 마우스 fMRI는 여러 가지 이유로 기술적으로 도전 남아있다1. 첫째, fMRI는 열악한 공간 및 시간적 해상도를 가지고 있습니다. 마우스 뇌의 작은 크기는 합리적인 공간 해상도를 달성하기 위해 비싼 스캐너를 사용하여 강한 자기장의 사용을 필요로한다. 둘째, 좁은 범위 내에서 안정적인 생리학적 파라미터를 유지하여 효율적인 신경 혈관 커플링을 허용하는 것은 마취마우스에서 매우 어렵다. 마지막으로, fMRI 연구가 의존하는 혈액 산소 수준 의존성 (BOLD) 신호는 상대적으로 가난한 감도를 가지고, 마우스에 적용 할 때 낮은 신호 대 잡음 비율로 이어지는 종종 작은 변화를 감지하기 위해 긴 인수에 반복 자극 프리젠 테이션을 필요로한다. 마우스는 생물 의학 전임상 연구에서 가장 널리 사용되는 동물 모델인, 이러한 제한은 부분적으로 신경 정신과의 번역 격차에 대한 책임이 있으며, 벤치에 새로운 유망한 치료 목표를 방해하여 침대 옆에서 효과적인 치료법으로 전환됩니다.
기능성 초음파(fUS)는 초고속 도플러2를기반으로 최근에 개발된 신경 이미징 기술이다. 대뇌 혈액 량을 직접 샘플링하여 이 기술은 신경 혈관 커플링을 통해 실시간으로 뇌 활동을 탐색할 수 있게 합니다. 다른 신경 이미징 기술에 비해 fUS는 100 μm의 공간 해상도와 수십 밀리초의 시간적 해상도를 생성합니다. 이 기술은 마우스 두뇌의 완전한 관상 동맥 단면도의 전체 두뇌 화상 진찰을 허용합니다, 완전히 비침습적으로. 또한, 의식과 행동 동물3,4,5와완벽하게 호환됩니다. fUS의 주요 현재 제한 사항 중 하나는 2D 기능으로 단일 관상 평면을 동시에 기록할 수 있습니다. 2D 매트릭스 어레이 트랜스듀서를 사용하는 체피 3D fUS는 이미 쥐6에서 성공적으로 입증되고 마우스7에서확인되었지만, 현재 감도 부족은 전체 두개내 절제술뿐만 아니라 활동의 약간의 변화를 감지하기 위해 중요한 수의 시험을 평균화해야 합니다. 또는 선형 트랜스듀서가 여러 위치를 가로질러 밟고 전체 뇌를 커버하기 위해 평면으로 기능성 이미징 평면을 수행할 수 있습니다. 그러나, 이 기술은 수많은 실험 패러다임 반복이 필요하며, 이러한 긴 수집 시간(마우스 뇌의 경우 3-4시간)8,9.
본 작품에서, 당사는 시험및 깨어있는 마우스에서 3D fUS 데이터를 취득하는 절차를 갖춘 시판기 기능 초음파 스캐너 및 빠른 평면 스위칭 선형 트랜스듀서를 포함한 견고한 실험 플랫폼을 설명하여, 비침습적으로, 조영제 없이 짧은 획득 시간 내에 마우스 뇌의 체적 및 경두개 기능 매핑을 허용합니다. 우리는 수염 자극뿐만 아니라 휴식 상태 기능 적 연결에 따라 somatosensory 피질 활성화를 매핑하여이 기능을 설명합니다. 동물 준비 및 데이터 수집 외에도 시각화, 아틀라스 등록 및 실시간 fUS 신호 분석 절차를 설명합니다.
Protocol
여기에 제시 된 모든 절차는 2010년 9월 22일 (010/63/UE)의 유럽 공동체 협의회 지침과 지역 윤리위원회 (코미테 데티에르 디페리멘션 동물 번호 59, ‘파리 센터 et Sud’, 프로젝트 #2017-23)와 합의하여 수행되었습니다. 성인 마우스(남성 C57BL/6 Rj, 나이 2-3개월, 20-30g, 프랑스 잔비에르 연구소)는 12시간 빛/어두운 사이클로 케이지당 4마리, 22°C의 일정한 온도, 음식 및 물 광고 리비툼을 보관하였다. 실험이 시작되기 전에 동물은 주거 조건에 대한 1 주일 최소 적응 기간이 주어집니다. 1. 마취 fUS 이미징을 위한 동물 제제 마취 마우스의 무게. 케타민과 자일라진의 혼합물을 10 mg/mL 및 2 mg/mL에서 각각 멸균 식염수로 준비합니다. 케타민/자일라진 용액의 0.2mL을 26게이지 바늘과 1mL 일회용 주사기를 사용하여 인트라피톤으로 관리한다. 몇 분 후, 동물이 스테레오탁스 프레임에 배치하여 머리가 평평하다는 것을 확인합니다. 마취제의 두 번째 볼륨을 관리하여 총 복용량에 도달 100 mg/kg 케타민과 20 mg/kg 자일라진 (초기 복용량을 고려).참고 : 마취는 1 시간 동안 지속되어야합니다. 더 긴 시간 동안 꾸준한 식기를 유지하려면 케타민 /자일라진 혼합물의 0.05 mL을 30 분마다 인과 회음부로 주입하십시오. 마취 된 이미징 세션을위한 동물 준비 이미징 세션 중 백내장 형성을 피하기 위해 마우스 눈에 일부 눈 연고(예: Ocry-Gel)를 적용합니다. 트리머를 사용하여 마우스 머리를 면도합니다. 몇 분 후 약간의 depilatory 크림을 바르고 헹구어. 머리카락이 완전히 제거될 때까지 반복합니다. 심전도(ECG) 레코딩을 위해 사지에 피하 핀을 삽입합니다. 원심 분리 된 초음파 젤 (1500 rpm, 5 분)을 머리에 놓습니다. 실험의 전체 기간 동안 마취의 깊이를 모니터링 (마취 유도 포함). 직장 프로브에 결합 된 가열 담요를 사용하여 37 °C에서 동물의 온도를 유지합니다. 마취 깊이의 간접 지표인 다음과 같은 생리학적 매개변수를 모니터링합니다: 심박수(분당 220-250회 – 심전도 박전극을 통해 피하됨), 호흡률(분당 130-140호흡 – 심전도 획득 시스템에 연결된 첨로메터를 사용하여 모니터링).참고: 실험 설정에 대한 설명은 그림 1에묘사됩니다. 그림 1: 마취 fUS 실험을 위한 실험 용 설정. 마취 실험 중에 필요한 모든 과학 장비를 보여주는 실험 용 설정에 대한 설명. 1. 생리적 모니터링 : 호흡기 및 심장 주파수 모두의 라이브 디스플레이. 2. Iconeus One 시스템(9)에서모니터링하는 4 축 모터 모듈 (3 개의 번역 및 1 회 회전)을 모니터링하고 경두개 3D 단습 스캔 또는 4D 인수를 수행 할 수 있습니다. 3a. 수염 자극기를 구동하는서보모터(3b.) 서보모터는 이미징 시퀀스와 자극 패턴을 동기화하기 위해 아이코누스 원시스템(9)과인터페이스되는 아두이노 우노 카드에 의해 제어된다. 4.a. 주사기 펌프 컨트롤러. 4.b. 주사기 홀더. 5.a. 가열 판을 제어하는 온도 플레이트 모니터. 5.b. 온도 판 모니터(5.a.)와인터페이스 가열 플레이트 및 직장 온도계. 6. 동물의 머리와 초음파 프로브 사이에 배치 된 초음파 젤은 그들 사이의 음향 커플링을 제공합니다. 7. 15 MHz 초음파 프로브. 8. 프로브(7)를모터 모듈(2)에연결하는 프로브 홀더. 9. Iconeus One 장비 및 소프트웨어, 상이한 이미징 서열을 프로그래밍하고 모터모듈(2)프로브구동(7)을제어할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. 깨어 있는 머리 고정 마우스 실험을 위한 동물 제제 헤드 플레이트 수술 마취된 동물(1.1-1.2단계)을 가열 패드(37°C)에 스테레오탁스 프레임에 놓습니다. 눈에 보호 젤을 바르고 리도카인 s.c.(0.2mL, 2%)를 26게이지 바늘을 사용하여 두피 피부 아래에 투여하고 몇 분 간 기다립니다.참고: 10-30분마다 마취 수준을 단단한 발가락 핀치에 대한 응답(부재)으로 모니터링합니다. 후두 뼈 뒤에서 비강 뼈의 시작부분에 이르기까지 처진 봉합사 다음에 절개를 수행합니다. 외과 가위를 사용하여 두 반구 를 통해 피부를 소비합니다. 1% 요오드 용액으로 두개골을 청소하고 남은 음막 제거합니다. 헤드플레이트를 템플릿으로 사용하여 두개골에 두 개의 구멍(직경 1mm)을 드릴링하여 앵커링 나사를 배치합니다.주의: 뇌 손상이나 두라 염증을 피하기 위해 두개골을 완전히 뚫지 않도록 주의하십시오. 헤드 플레이트를 나사로 배치합니다. 치과 시멘트를 사용하여 프레임 앞과 뒤쪽의 나사와 헤드 플레이트를 고정하여 임플란트의 좋은 그립을 유지합니다.주의: 신호 품질이 크게 감소하기 때문에 프레임 창 내부에 시멘트를 바르지 않도록 주의하십시오. 뼈를 보호하고 이미징 창의 측면에 상처를 밀봉하기 위해 수술 접착제의 얇은 층으로 두개골을 덮습니다. 시멘트가 건조 한 후 스테레오 택시 프레임에서 동물을 제거하고 1 mg / kg에서 atipamezole의 피하 주입에 의해 마취를 반전. 멜록시캄의 예방 투여 (5 mg/kg/일, s.c.) 수술 후 통증에 대 한 관리. 동물을 리커버리 케이지에 넣고 가열 패드(37°C)에 놓습니다. 마우스는 몇 시간 이내에 쓰레기와 함께 홈 케이지를 반환 할 수 있습니다. 자기 3D 인쇄 캡(자석 인서트가 있는 다각산 재료)을 헤드플레이트 위에 놓아보호(도 2A). 이동식 홈 케이지(MHC)에 대한 습관이 시작되기 4~6일 전에 마우스를 놓습니다.참고: 캡과 헤드플레이트의 총 중량은 2.8g입니다. 취급 및 습관 1일째 회복 후(PR)에서는 하루에 5~10분 동안 마우스를 조심스럽게 잡습니다. 2일째 PR에서는 1일째와 같이 취급을 반복하고 5-10분 동안 동물을 자유롭게 MHC로 탐험합니다.참고: 방에서 배경 음악을 재생하면 동물의 스트레스를 줄일 수 있습니다. 3일 PR에서 동물은 5-10분 동안 MHC를 자유롭게 탐험하게 하십시오. 그 후, 조심스럽게 헤드 플레이트를 잡고 부드럽게 클램프에 배치, 수동으로 마우스와 함께 탄소 케이지를 이동. 5-10 분 동안 머리 고정 위치에 동물을 습관화. 70% 에탄올 용액으로 훈련 세션 사이에 MHC를 청소하고 수돗물로 헹구습니다.참고: MHC가 제조업체에서 권장하는 대로 충분한 공기 흐름을 수신해야 합니다. 편안한 위치를 제공하기 위해 헤드 클램프의 높이를 수동으로 조정해야 합니다. 4일과 5일 PR에서는 마우스 MHC를 반복적으로 고정하고 5분에서 최대 30분까지 점진적으로 헤드 고정 시간을 늘립니다. 화상 진찰 창에 식염수 및 초음파 젤을 바르면 습관화하십시오. 6일째 PR에서는 4/5 PR일로부터 프로토콜을 반복하고 3.1단계에 따라 동물의 머리 위에 프로브를 배치합니다. 실험 당일, 위에서 설명한 대로 진행한다. 그런 다음, 식염수로 이미징 창을 가습하고 일부 초음파 젤을 적용합니다. 동물의 추적을 시작하고 프로브 위치(아래 참조)로 진행합니다.참고: MHC내 클램핑은 마우스를 걸레에 싸서 수행될 수도 있다. 이 경우 마우스는 헤드 고정 전에 래핑 절차에 습관화되어야 합니다. 도 2B에서깨어 있는 이미징에 대한 완전한 실험 설정에 대한 설명이 제공됩니다. 그림 2: 깨어 있는 fUS 실험을 위한 실험 용 설정. A. 이미징 창을 보호하는 헤드 플레이트 자기 커버의 회로도 그림 (BioRender.com 함께 생성됨). 이미징 세션 동안(왼쪽), 커버는 헤드 플레이트에서 제공하는 큰 조리개에서 뇌를 스캔하기 위해 제거됩니다. B. 머리 고정 자유롭게 행동하는 마우스에서 경두개 깨어 있는 이미징을 위한 실험적인 설정의 사진. 1. Iconeus One 시스템과 소프트웨어로 다양한 이미징 시퀀스를 설정하고 모터 모듈을 제어할 수 있습니다. 2. Iconeus One 시스템(1)에서모니터링하고 3D 지형 스캔 또는 4D 인수를 허용하는 4 축 모터 모듈 (3 개의 번역 및 1 회전). 3. 공기 분배 테이블. 4. 모바일 홈 케이지 (MHC). 5a,5b. MHC 내부의 동물의 환경을 자세히 볼 수 있는 사진. 6. 헤드 플레이트를 고정하는 헤드 고정 시스템. 7. 프로브를 모터 모듈(2)에 연결하는 프로브 홀더. 8. 15 MHz 초음파 프로브. 9. 마우스 헤드와 초음파 프로브 사이에 배치 된 초음파 젤은 그들 사이의 음향 커플링을 제공합니다. 10. 수염 자극기를 구동 하는 서보 모터. 서보 모터는 이미징 시퀀스와 자극 패턴을 동기화하기 위해 TTL 신호(1)를 통해 Iconeus One 시스템과 인터페이스되는 Arduino Uno 카드로 제어됩니다. C. 서로 다른 공간 샘플링 가능성(BioRender.com 함께 생성된)의 그림) 각 경우 프로브는 첫 번째 위치에서 마지막 위치로 단계별로 단계별이며 도플러 이미지는 각 위치에 기록되어 쌓인 볼륨을 재구성합니다. 이 프로세스는 전체 획득 시간 동안 지속적으로 반복됩니다. 조밀한 스캔(왼쪽): 슬라이스 사이의 단계는 볼륨 이미징을 허용하기 위해 충분히 작아야 합니다(일반적으로 고도 해상도에 해당하는 400 μm). 스파스 스캔(오른쪽): 먼 기능 영역이 타겟팅되는 경우(다른 위치에서), 시간 샘플링을 손상시키지 않으면서 이러한 영역을 교차하는 다른 슬라이스를 이미지화하도록 공간 샘플링을 줄일 수도 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. 프로브 포지셔닝 소프트웨어(예: IcoScan)를 시작하고 실험 세션을 만듭니다. 이동 프로브 메뉴로 이동하여 내비게이션 키보드를 사용하여 초음파 프로브의 위치를 조정합니다.참고: 프로브는 동물의 머리 위에 약 1mm 를 배치해야 합니다. 프로브가 이미징 서열을 시작하기 전에 초음파 젤과 접촉하는 것이 중요합니다. 동물 CBV(대뇌 혈액 부피)의 실시간 이미징을 통해 필요한 경우 라이브 뷰 획득을 시작하고 프로브 위치를 조정합니다. 이미지의 중심에 뇌를 정렬합니다. 이미징 매개 변수를 최적화하여 가장 높은 신호 대 잡음 비율을 캡처합니다.참고: 깨어 있는 마우스 실험에서는, 조리개 크기는 측량 근육 수축에 의해 유도된 동맥을 피하기 위하여 감소될 필요가 있습니다. 4. 혈관 검사 및 아틀라스 등록 인수 소프트웨어에서 Angio 3D 옵션을 엽니다. 사전 설정 패널에서, 전체 뇌를 스캔하기 위해 스캐닝 매개변수(첫번째 슬라이스, 마지막 슬라이스 및 단계 크기)를 조정하고 인수를 시작합니다.참고: 스캔 매개 변수를 설정할 때 스캔이 뇌의 후방 부분을 커버하는지 확인합니다. 수집 소프트웨어를 열어 두고 데이터 분석 및 시각화(예: IcoStudio)를 위한 소프트웨어를 시작하고 angio 3D 스캔을 로드합니다. 3뷰 패널을 사용하여 획득 볼륨을 탐색하고 코로날 스캔 방향:antero 후방 또는 후방 을 선택합니다. 뇌 등록 패널로이동합니다. 등록 프로세스에 필요한 마우스 참조 템플릿을 로드합니다. 완전 자동 또는 수동 등록모드(그림 3C)를사용하여 앨런 마우스 공통 좌표 프레임워크에 스캔을 등록합니다. 혈관 3D 스캔 및 참조 템플릿의 중첩을 보거나 아틀라스 관리자 패널(그림3D)을사용하여 스캔 및 알렌 참조 아틀라스의 중첩을 확인하여 결과를 확인합니다. 등록을 .bps 파일로 저장합니다.참고: 동일한 실험 세션 중에 수행되는 다른 인수에 대해 등록 파일을 다시 사용할 수 있습니다. 5. 뇌 포지셔닝 시스템 (BPS) IcoStudio 소프트웨어에서 혈관 검사및 .bps 파일(4.4 단계에서생성됨)이 로드되어 있는지 확인합니다. 뇌 탐색 패널로 이동합니다. 아틀라스 매니저 패널에서 부모/자식 트리 네비게이터로 마우스 앨런 뇌 아틀라스를 탐색합니다. 해부학 적 대상 지역을 찾아 3 뷰에서 스캔에 중첩하도록 선택하십시오. 3뷰 패널에서 대상 영역을 시각화하고 실험대상 영역과 겹치는 이미징 평면을 선택합니다. 이렇게 하려면 관심 영역을 포함하는 관상 위치에 두 개의 마커를 수동으로 설정합니다. 뇌 포지셔닝 시스템(BPS)을 클릭하여 결과 모터 좌표를 추출합니다. 이러한 좌표는 대상 평면을 이미지화할 수 있는 프로브 위치에 해당합니다. angio 검사에서 계산된 이미지의 미리 보기를 확인합니다. IcoScan 소프트웨어에서 프로브 위치 지정 패널을 입력하고 BPS 좌표를 입력합니다. 5.4 단계에서주어진 좌표를 적용합니다. 프로브는 표적 이미징 평면에서 이동하고 정렬합니다. 라이브 뷰 수집을 수행하고 현재 이미징 평면이 5.4 단계에서주어진 예측에 해당하는지 확인한다.참고: 기병대/비직교 평면을 선택할 수도 있습니다. 그림 3: 정밀 프로브 포지셔닝을 위한 빠른 경두개 혈관 검사 및 뇌 등록. A. 마우스 뇌의 회로도 표현은 빠른 혈관 전지 스캔 중에 첫 번째 관상 동맥 슬라이스 (녹색)에서 마지막 관상 슬라이스 (파란색)까지 초음파 프로브에 의해 경감적으로 스캔됩니다. 현재 이미지 된 슬라이스 (빨간색으로 표시)는 뇌의 앞면 (파란색)으로 뒤쪽 (녹색)에서 단계별로 이동합니다. Angio 3D 패널에서 IcoScan 인수 소프트웨어의 BioRender.com B. 스크린 샷으로 만들어졌습니다. 오른쪽의 사전 설정 매개 변수는 빠른 스캔을 구성합니다. 첫 번째 슬라이스의 mm의 위치, 마지막 슬라이스 및 단계 크기는 뇌 전체를 선형으로 스캔하도록 선택해야합니다. C. IcoStudio 처리 소프트웨어의 스크린 샷. 빠른 Angio 3D 검사는 마우스 뇌의 참조 템플릿에 자동으로 등록됩니다. 세 보기 (왼쪽)는 관상, 처진 및 축 보기에서 혈관과 마우스 뇌 알렌 아틀라스의 중첩을 보여줍니다. D. 3D 혈관 검사에서 16개의 슬라이스(31개 중)의 선형 레이아웃(몽타주)이 등록된 알렌 레퍼런스 아틀라스를 혈관에 겹쳐 놓습니다. E. 왼쪽 및 오른쪽 기본 체감각 피질, 배럴 필드 영역의 중앙에 배치된 두 개의 마커 덕분에 소프트웨어에 의해 계산된 모터 좌표에 대응하는 예측 이미징 평면을 보여주는 뇌 탐색 패널의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 6. 작업 에서 불러 일으킨 실험 : 수염 자극 자극 시간, 자극 간 시간 및 반복 횟수를 포함하여 자극 시퀀스를 미리 정의합니다. 총 획득 시간, 위치 수, 포지션 간의 데드타임을 정의하여 3D fUS 시퀀스를 실행합니다. TTL 입력을 통해 인수 시스템과 동기화된 자동 자극의 경우 인수를 시작하기 전에 Trig-IN 옵션을 선택합니다.참고: 이 작품에 제시된 결과에 대해, 자극은 등/복부 방향으로 대부분의 수염을 편향시킬 수 있도록 배치된 면봉을 사용하여 전달되었다. 동기화를 보장하기 위해 이코누스 원 시스템에 연결된 아두이노 UNO 카드가 구동하는 서보 모터에 고정되었습니다. 자극에 권장되는 매개 변수는 30 s ON, 30 s OFF, 20° 및 4Hz 주파수의 진폭입니다. 또는, 자극은 또한 획득 하는 동안 정의 된 시간에 수염을 편향 하 여 수동으로 전달 될 수 있습니다. IcoStudio 소프트웨어에서 인수를 열고 활성화 맵 메뉴를 입력합니다. 시작 시간 및 종료 시간으로 활성화 패턴 필드를 채우고 활성화 맵을 계산합니다. 시각화를 위해 표시 매개 변수를 조정합니다. 활성화 맵을 오프라인 분석을 위한 .h5 파일로 내보냅니다.참고: 활성화는 기본 마우스 혈역학 반응(HRF)에 의해 수렴된 자극을 가진 일반화된 선형 모델(GLM) 접근법을 사용하여 추정됩니다. 대안적으로, 활성화는 각 복셀에서 자극 패턴과 혈역학 신호 사이의 Pearson 상관관계를 추정함으로써 직접 시각화될 수 있다. 7. 4D 기능 연결 총 획득 시간, 이미징 평면 위치 수, 위치 간의 데드 타임을 정의하여 3D fUS 시퀀스를 실행합니다.참고: 4D 기능 연결의 경우 각 볼륨 )을 획득하는 것이 좋습니다. 인수를 저장하고 IcoStudio 소프트웨어에 로드합니다. 필요한 경우 .bps 파일과 앨런 마우스 뇌 좌표 프레임워크를 로드합니다. 아틀라스 관리자에서아틀라스 지역을 관심 영역(ROI)으로 선택합니다. 기능 연결 메뉴를 입력하고 ROI 관리자에서 원하는 영역을 선택합니다. 결과를 연결 행렬(감독 분석) 또는 시드 기반 상관 관계 맵(감독되지 않은)으로 시각화합니다. 대역폭 필터를 원하는 대로 선택하고 조정하고 통계 분석을 위한 상관 관계 결과를 내보냅니다.참고: 3D fUS 이미징 모드에서 상대 프로브 위치가 수동으로 설정됩니다. 따라서, 두 가지 유형의 검사가 가능하고 기능적 응용 프로그램에 따라 선택할 수 있습니다: 조밀한 스캔 대 스파스스캔(도 2C).
Representative Results
이 프로토콜은 마우스 뇌의 뇌, 휴식 또는 감각 자극에 대한 응답으로 뇌 용혈역학 변이의 3D 정량화를 설명합니다. 설치류에서 뇌 기능 활성화를 매핑하는 표준 패러다임인 수염 자극은 감각 자극-자극 반응의 예로 선택되었습니다. 도 4는 경두개 fUS 이미징을 사용하여 얻은 마취 마우스에서 기계적 수염 자극에 대한 반응으로 대표적인 활성화 맵을 나타낸다. 총 시험 시간은 760s였으며, 60s 기준선(자극 전후), 80s 자극 및 60s 복구 시간, 5배 반복. 기본 마우스 혈역학 응답 함수(HRF)를 사용하여 일반 선형 모델(GLM)의 해상도로 상당한 활성화가 결정되었다. 활성화 된 영역 (p 값>0.00000006 여러 비교에 대 한 엄격한 Bonferroni 보정 후 Z 점수) 알렌 공통 좌표 프레임 워크 템플릿에 오버레이 색상 코딩 값으로 표시 됩니다. 복셀-현명한 시간 과정 의 금단적인 기본 somatosensory 피질, 배럴 필드 영역 (S1BF) 발표 15-20% 기준선에 비해 CBV의 증가. 그림 4: 케타민 /자일라진 마취 마우스에서 수염 자극다음 경두개 활성화지도 및 rCBV 시간 과정. A. 케타민/자일라진 마취 하에서 오른쪽 수염(80s ON, 60s OFF,5x)을 기계적 자극한 후 크게 활성화된 복셀을 보여주는 활성화 맵. 지도는 여러 비교를 위해 Bonferroni 보정을 통해 일반 선형 모델 분석(GLM)을 기반으로 Z 점수를 계산하여 획득했습니다. Z-점수(색상 코드)는 알렌 뇌 3D 템플릿(뇌 포지셔닝 시스템으로 등록 한 후)에 오버레이되고 관상 (왼쪽), 처진 (가운데) 및 축 (오른쪽)의 세 가지 보기에 표시됩니다. 알렌 마우스 뇌 공통 좌표 프레임 워크에서 해부학 영역 참조를 위해 표시 됩니다. 활성화 된 복셀은 왼쪽 S1BF 피질 내부에 잘 있습니다. 스케일 바: 1mm. 각 샘플 부피는 3.85s에서 2.8mm(고도 방향으로 7개의 슬라이스에 해당)를 통해 스캔하여 각 기능 반응 중에 20개의 볼루믹 샘플을 기록할 수 있도록 했습니다. B. 수염 자극-발췌 상대 대뇌 혈액 볼륨 (rCBV)의 3D 렌더링 기준선 수준에 비해 증가. S1BF의 해부학적 묘사는 파란색으로 표시됩니다. C. 왼쪽 S1BF(파란색)와 적용된 자극(red)의 CBV 변형의 시간 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 동일한 패러다임은 IcoScan의 깨어있는 사전 설정을 사용하여 모바일 홈케이지의 헤드 고정 행동 마우스에 적용되었습니다. 도 5는 도 2에 기재된 실험 설정을 이용한 다중 수염 자극 실험 후 활성화 맵을 제시한다. 몇 가지 후방 및 caudal 수염은 다음과 같은 패턴으로 자극되었다 : 30 s 기준선 30 s ON (4 Hz)과 30 s OFF(그림 5C)의5 연속 시험 다음. 자극은 아두이노 UNO 카드로 구동되는 서보 모터를 사용하여 전달되었으며, 동기화를 위해 이미지 수집 시퀀스를 트리거합니다. 기본 마우스 혈역학 응답 함수(HRF)를 사용하여 일반 선형 모델(GLM)의 해상도로 상당한 활성화가 결정되었다. 여러 비교 보정은 본페로니 방법으로 수행되었다. 종래의 알파 레벨 0.05는 인수 물량의 총 복셀 수에 의해 정상화되어 최종 엄격한 임계값인 0.000003을 초래했다. 그림 5: 활성화지도 및 rCBV 시간 과정 깨어 있는 행동 마우스에서 수염 자극 다음. A. 모바일 홈케이지의 깨어있는 마우스에서 오른쪽 수염 (30 s ON, 30 s OFF, 5x)의 기계적 자극에 따라 크게 활성화 된 복셀을 보여주는 활성화지도. 지도는 여러 비교(총 복셀 수에 의한 정규화)를 위해 Bonferroni 보정을 통해 일반 선형 모델 분석(GLM)을 기반으로 Z 점수를 계산하여 획득했습니다. Z-점수(색상 코드)는 알렌 브레인 3D 템플릿(뇌 포지셔닝 시스템 등록 후)에 오버레이되어 관상(왼쪽), 처상(가운데) 및 축(오른쪽)의 세 가지 보기로 표시됩니다. 알렌 마우스 뇌 공통 좌표 프레임 워크에서 해부학 영역 참조를 위해 표시 됩니다. 활성화 된 복셀은 왼쪽 S1BF 피질 내부에 잘 있습니다. 비늘 바, 1mm. 각 샘플 부피는 3.85s에서 1.6mm(고도 방향으로 3개의 슬라이스에 해당)를 스캔하여 각 기능 반응 중에 17개의 볼루믹 샘플을 기록할 수 있도록 했습니다. B. 수염 자극-발췌 상대 대뇌 혈액 볼륨 (rCBV)의 3D 렌더링 기준선 수준에 비해 증가. S1BF의 해부학적 묘사는 파란색으로 표시됩니다. C. 오른쪽 수염 자극 실험 중 이동식 홈케이지에서 마우스의 그림이 330sD의 총 획득 시간 동안 5개의 30s 시험을 수행하였다. 즉각적인 상대CBV 시간 코스는 활성화 된 영역 (파란색) 내에서 추출, 해당 자극중첩 (빨간색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 6은 케타민-자일라진 마취 마우스에서 정규화된 저주파(<0.2Hz) 자발적인 CBV 변동(등록에서 알렌 공통 좌표 프레임워크로 식별)의 시간적 상관관계를 나타낸다. 총 취득 시간은 20분(1200초)이었습니다. 아틀라스 감독 분석 결과 상관 관계 계수 값이 0.8까지 인하여 강력한 상호 연결 패턴을 나타났습니다. 등회 해마의 종자 기반 분석은 오른쪽해마와 왼쪽 해마 사이의 상당한 상호 연결뿐만 아니라 깊은 복고풍 해마 지역과 piriform 코르티체를 밝혀냈습니다. S1BF에서 선택된 종자 영역은 또한 이전에 설명한 대로 대칭(cortico-cortical) 상관 관계 패턴을 초래하였다. 그림 6: 케타민/자일라진 마취 하에서 마우스 뇌의 경두개 체적-좌식 상태 기능적 연결은 20분 3D fUS 획득시 평가되었다. A. 경두개 기능 획득에 등록된 Allen 공통 좌표 프레임워크의 3D 영역을 기반으로 하는 상관 행렬. 매트릭스는 슬라이스 타이밍 보정 후 식별된 각 ROI에 포함된 모든 복셀의 평균 시간 신호의 정규화된 Pearson의 < 정규화된 Pearson의 상관관계를 계산하여 얻어진다. 각 샘플링된 부피는 2.2s. B이상 획득한 고도 방향으로 1.6mm 이상(4슬라이스에 해당)을 통해 스캔하였다. 3D 템플릿에 투영된 시드 기반 분석입니다. 씨앗은 β – 2.1 mm에서 오른쪽 등쪽 해마 내에서 선택되었다. 상관 관계 맵은 슬라이스 타이밍 보정 후 종자의 시간적 신호와 전체 획득의 각 복셀 사이의 Pearson 상관 관계 계수를 계산하여 가져옵니다. C. s1BF 내에서 선택된 종자 영역을 기반으로 하는 종자 기반 분석을 기반으로 하는 C. 3D 상관관계 맵은 β – 2.1mm이다. 규모 막대: 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
전체 뇌 이미징 방법은 뇌 생리학 과 병리학을 더 잘 이해하는 중요한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 벤치에서 직접 살아있는 두뇌에 있는 혈역학 신호의 정확한 정량화를 허용합니다. 기능성 초음파의 타의 추종을 불허하는 감도 및 스파티오 -측두형 해상도는 마우스 생리학에 특히 적합합니다. 기능적 응답 및 휴식 상태 네트워크는 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위해 시험이나 주체를 평균할 필요 없이 짧은 획득 시간 내에 세로로 매핑할 수 있습니다. 고감도 초음파 선형 프로브와 빠른 동력 설정의 관련 조합은 합리적인 획득 시간 내에 마우스에서 경두개 체적 fUS 이미징을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 모바일 홈 케이지를 사용하여 마취 또는 깨어 있는 마우스에서 수행될 수 있다.
수염 자극, 이 원고에서 설명하는 예로 사용되는 감각 자극은 설치류의 표준 기능 활성화 패러다임과 감각 처리, 신경 혈관 커플링 및 변경5,6,10,11을연구하기 위한 신뢰할 수 있는 판독이다. 수염의 거친 수동 칫솔질이 사용 편의성을 위해 선호될 수 있지만,이 방법은 공간 및 시간 적 정밀도가 부족합니다. fUS 이미징 스캐너로 발동된 것과 같은 자동 자극제의 사용은 발병 시간, 진폭 변위, 주파수 뿐만 아니라 Q-tip/comb의 각도를 포함한 여러 파라미터를 더 잘 제어할 수 있게 해 주어 동물 간 재현성을 향상시게 합니다. 또한, 보다 정확한 자극 타이밍을 통해매개변수(12,13)를최대화할 시간 및 시간을 결정하여 혈역학 반응 함수(HRF)를 모델링할 수 있다. 자극 중에 편향된 수염 수(따라서 활성화된 영역)에 대한 정밀도를 높이기 위해 보다 정교한 자극기는 이 프로토콜에 맞게 조정할 수 있습니다. 빛8,사운드 14 또는 냄새 프리젠테이션(15)과 같은 다른 많은 자극은 동일한 프로토콜을 사용하여 구현될 수 있다.
기능성 초음파와 깨어 있고 행동하는 동물의 호환성은 다른 신경 이미징 기술에 비해 중요한 이점이며 마취 편향없이 기능적 활성화 매핑을 가능하게합니다. 공기 가 들어 올린 모바일 홈케이지를 사용하는 것은 선형 또는 구형 러닝머신과 같은 다른 기존 헤드 고정 장치에 대한 좋은 대안입니다. 단단히 헤드 고정되는 동안, 홈 케이지의 움직임은 마우스에게 환경을 탐색 할 수있는 환상을 제공, 행동 테스트의 넓은 범위가 fUS 이미징에 결합 할 수 있도록(16). 그러나 헤드 픽싱에 대한 습관적 절차는 특히 혼란스러운 요인으로 간주 될 수있는 실험에서 스트레스를 줄이는 중요한 단계를 구성합니다. 여기에 자세히 설명된 절차(헤드 고정에 대한 6일 간의 처리 및 습관)는 감각 자극 및 휴식 상태 기능 적 연결에 대한 강력한 결과를 제공합니다. 그러나 보다 세련된 행동테스트(17)를위해 상습 기간을 연장해야 할 수도 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 유럽 연구 위원회 (ERC) 고급 그랜트 N ° 339244-FUSIMAGINE에 의해 지원되었다, 국립연구청 ‘핀치'(ANR-18-CE37-005), 생물의학 초음파 의 인서름 연구 기술 액셀러레이터, IPNP의 엘프US 기술 핵심, Inserm U1266, 인간 뇌 프로젝트의 유럽 연구 프로그램 FUSIMICE, EMBO 단기 펠로우십 8439
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
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Cite This Article
Bertolo, A., Nouhoum, M., Cazzanelli, S., Ferrier, J., Mariani, J., Kliewer, A., Belliard, B., Osmanski, B., Deffieux, T., Pezet, S., Lenkei, Z., Tanter, M. Whole-Brain 3D Activation and Functional Connectivity Mapping in Mice using Transcranial Functional Ultrasound Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62267, doi:10.3791/62267 (2021).