Двойная маркировка иммунофлуоресценции с использованием антител одного и того же вида для изучения взаимодействий хозяина и патогена
Summary
Здесь протокол описывает, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Кроме того, он может включать третье антитело от другого хозяина в этот протокол. Такой подход может быть выполнен в любом типе клеток и патогенов.
Abstract
В настоящее время можно найти широкий спектр молекулярных инструментов, доступных для изучения взаимодействия паразитов и клеток-хозяев. Однако существуют некоторые ограничения для получения коммерческих моноклональных или поликлональных антител, которые распознают специфические клеточные структуры и белки у паразитов. Кроме того, существует мало коммерческих антител, доступных для маркировки трипаносоматидов. Обычно поликлональные антитела против паразитов готовятся собственными силами и могут быть более сложными для использования в сочетании с другими антителами, продуцируемыми у того же вида. Здесь протокол демонстрирует, как использовать поликлональные и моноклональные антитела, выращенные у одного и того же вида, для выполнения двойной маркировки иммунофлуоресценции для изучения взаимодействия клеток хозяина и патогенов. Для достижения двойной маркировки иммунофлуоресценции крайне важно инкубировать сначала поликлональное антитело мыши, а затем следовать за инкубацией с вторичным мышиным антителом IgG, конъюгированным с любым фторхромом. После этого необходим дополнительный блокирующий этап, чтобы предотвратить распознавание любого следа первичного антитела следующим вторичным антителом. Затем к образцу добавляют моноклональное антитело мыши и его специфическое вторичное антитело подкласса IgG, конъюгированное с другим фторхромом. Кроме того, можно выполнить тройную маркировку иммунофлуоресценции с использованием третьего антитела, выращенного у другого вида. Кроме того, такие структуры, как ядра и актин, могут быть окрашены впоследствии их специфическими соединениями или метками. Таким образом, представленные здесь подходы могут быть скорректированы для любой клетки, источники первичных антител которой ограничены.
Introduction
Изучение взаимодействия патогена с клеткой-хозяином на клеточном уровне предоставляет важную информацию об основных причинах заболевания, поскольку различные группы, такие как вирусы, бактерии и простейшие, могут заражать большинство типов клеток-хозяев 1,2,3,4. Это также может помочь разработать и идентифицировать потенциальные терапевтические цели, которые могут замедлить или ингибировать рост патогена. В живых условиях вырабатываемые антитела отвечают за распознавание самокомпонентов, антигенов из вирусов, бактериальных компонентов или продуктов, грибков, паразитов и др.5.
Для этой цели антитела широко используются инструментами, в основном для понимания расположения и функции клеточных структур и белков. Несколько исследований с использованием множественной маркировки антител показывают, что дополнительные блокирующие этапы способствуют специфичности иммунолокализации. Кроме того, в большинстве описанных протоколов используются специфические коммерческие моноклональные антитела, включая антитела от одного и того же вида хозяина6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Обычно двойная маркировка иммунофлуоресценции использует два антитела, выращенных у разных видов, чтобы окрашивать интересующие клеточные структуры или патогены и клетки-хозяева, чтобы увидеть взаимодействие между ними. Однако это может быть проблемой, когда коммерческие моноклональные или поликлональные антитела, специфичные для некоторых патогенов, недоступны для выполнения двойной маркировки. Кроме того, существуют коммерчески доступные наборы конъюгации антител, и можно конъюгировать первичные антитела непосредственно к флуорофору с помощью реакции сукцинимидилового эфира15. Проблема в том, что эти наборы часто дорогие, и необходимо иметь достаточно антител, чтобы маркировать их. Зная это, мы успешно разработали метод двойной иммунофлуоресценции с использованием двух разных антител, выращенных у одного и того же вида, для изучения локализации белка в Trypanosoma brucei16. Однако для внутриклеточных паразитов, включая Trypanosoma cruzi, такой подход не был продемонстрирован. Здесь мы покажем, как выполнить двойную маркировку иммунофлуоресценции для изучения внутриклеточных паразитов T. cruzi и клетки-хозяина с использованием первичных антител, выращенных у одного и того же вида без перекрестных реакций. Кроме этого метода установлена тройная иммунофлуоресцентная маркировка с добавлением третьего антитела от другого вида. Эти подходы помогают, когда источник антител ограничен и может быть использован в любом типе клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем протокол для выполнения двойной иммуномаркировки инфицированных Trypanosoma cruzi клеток с использованием двух разных антител от одного и того же вида-хозяина. Чтобы изучить более подробно последствия инфекции, структуры в клетке-хозяине, такие как ядро или цитозол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом Ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) для MMAB, Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA для MMAB и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – финансовый код 001. CG-C получил магистерскую и докторскую стипендию от CAPES, а LAMT-S получил докторскую стипендию от CNPq. Мы благодарим Элизабет Р. Милани за помощь в конфокальной микроскопии и доктора Дарио Замбони за предоставление клеток LLC-MK2 (Медицинская школа Рибейрао Прету, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
References
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
- Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
- Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
- Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
- Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
- Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
- McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
- Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
- Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
- Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
- Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
- de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
- Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
- Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
- Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
- Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
- Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
- Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).
