In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi
Summary
Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Değişmez Doğal Öldürücü T (iNKT) hücreleri, polimorfik olmayan MHC sınıfı I ile ilişkili molekül CD1d. Preklinik ve klinik çalışmalar kanser, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarda iNKT hücreleri için bir rolü desteklemektedir. iNKT hücreleri türler boyunca çok korunmuş ve cd1d eksikliği veya iNKT eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri tarafından araştırılmıştır ve yarı sabit TCR’ye özgü CD1d tetramerleri veya mAb’leri olan farelerde ve erkeklerde bunları kesin olarak tespit etme imkanı. Bununla birlikte, iNKT hücreleri nadirdir ve herhangi bir çalışma için yönetilebilir sayılara ulaşmak için genişletilmeleri gerekir. Birincil fare iNKT hücre hattı in vitro’nun üretimi zor olduğu kanıtlandığı için, iNKT hücrelerinin 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerden (iVα14Tg) dalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için sağlam bir protokol kurduk. Burada birincil dalak iVα14Tg iNKT hücrelerinin immünomanyetik bir ayırma işlemi ile zenginleştirilerek yaklaşık% 95-98 saf iNKT hücresi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Saflaştırılmış iNKT hücreleri anti-CD3/CD28 boncuklar artı IL-2 ve IL-7 ile uyarılır ve bu da kültürün %85-99 saflığı ile +14 gün boyunca 30 kat genişlemeye neden olur. Genişletilmiş iNKT hücreleri kolayca genetik olarak manipüle edilebilir, aktivasyon ve fonksiyon in vitro mekanizmalarını parçalamak için paha biçilmez bir araç sağlar ve daha da önemlisi, in vivo olarak benimsenen transfer üzerine.
Introduction
Değişmez Doğal öldürücü T hücreleri (iNKT hücreleri), MHC sınıfı I ile ilgili molekül CD1d2tarafından sunulan lipid antijenleri için özel olan sınırlı bir dizi farklı Vβ zinciri1ile eşleştirilmiş, farelerde yarı sabit bir αβ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden doğuştan gelen T lenfositlerdir. iNKT hücreleri, bir CD4+ ve bir CD4– alt kümesi üreten birkaç olgunlaşma aşaması3,4, ile meydana gelen timusta zaten aktif / doğuştan gelen bir efektör fenotipinin alınmasıyla sonuçlanan bir agonist seçim programına tabidir. Bu program sayesinde, iNKT hücreleri sırasıyla T-bet, GATA3, PLZF ve RORφt transkripsiyon faktörlerinin ifadesiyle tanımlanabilen TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) ve TH17 (iNKT17)olmaküzere farklı T yardımcı (TH)efektör fenotipleri edinir. iNKT hücreleri bir dizi mikrobiyal lipit tanır, ancak aynı zamanda kanser ve otoimmünite gibi hücre stresi ve doku hasarının patolojik durumları bağlamında güncellenmiş endojen lipitlere karşı kendi kendine reaktiftir2. Aktivasyon üzerine, iNKT hücreleri doğrudan temas ve sitokin üretimi ile diğer doğuştan gelen ve adaptif immün efektör hücrelerin işlevlerini modüleederek 2.
iNKT hücrelerinin araştırılması, CD1d eksikliği veya Jα18 eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri ve antijen yüklü CD1d tetramerlerin üretimi ve insan yarı sabit TCR’ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimi ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, birincil fare iNKT hücre hattının üretimi zor olmuştur. iNKT hücrelerinin antitümör işlevlerini daha iyi karakterize etmek ve bunları benimseyen hücre tedavisi için kullanmak için, iNKT hücrelerinin vahşi tip farelerden 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerin (iVα14Tg)6’nındalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için bir protokol belirledik.
Genişletilmiş iNKT hücreleri in vitro tahliller için kullanılabilir ve farelere geri transfer edildikten sonra in vivo olarak kullanılabilir. Bu ortamda, örneğin, güçlü anti-tümör etkilerini gösterdik7. Ayrıca, in vitro genişletilmiş iNKT hücreleri, enjeksiyonlarından önce gen transferi veya düzenleme yoluyla fonksiyonel modifikasyonaelverişlidir invivo 8 Moleküler yolların içgörülü fonksiyonel analizine izin vermenin yanı sıra gelişmiş hücre tedavilerinin önünü açmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada milyonlarca kullanıma hazır iNKT hücresi elde etmek için tekrarlanabilir ve uygulanabilir bir protokol gösteriyoruz. Bu hücrelerin vivo’nun azlığı nedeniyle, onları genişletmek için bir yönteme çok ihtiyaç vardı. Önerdiğimiz protokol ne belirli bir enstrümantasyon ne de yüksek sayıda fare gerektiriyor. İşlem için gerekli fare sayısını azaltmak için iVα14-Jα18 transgenik farelerden bilerek yararlandık.
iVα14-Jα18 transgenik farelerden iNKT hücre genişle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Paolo Dellabona ve Giulia Casorati’ye makalenin bilimsel desteği ve eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Nih Tetramer Çekirdek Tesisi’ne fare CD1d tetramer için de teşekkür ederiz. Çalışma Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (M.F.’ye) ve İtalyan Kanser Araştırmaları Derneği (AIRC) bursu 2019-22604 (G.D.’ye) tarafından finanse edildi.
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
