인간 가래 샘플에서 호중구 엘라스테아제 및 카테프신 G 활동 모니터링

다음 프로토콜은 인간의 가래에 수행 된 분석을 설명합니다. 인간 샘플 처리는 하이델베르크 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었으며 모든 환자 또는 부모 / 법적 보호자 (S-370/2011) 및 건강한 통제 (S-046/2009)로부터 서면 통보 된 동의를 얻었습니다. 참고: 다음 프로토콜은 호중구 세린 프로테아제(NSP) 활성의 샘플 준비 및 정량화를 설명합니다. 본 원에 제시된 실험 절차는 인간 가래 및 호중구 엘라서아제14,20,21(NE) 또는 카테핀 G15(CG) 활동 측정에 초점을 맞춥니다. 그러나, 시료 제제 프로토콜에서 약간의 적응은 혈액 유래 세포 및 종양균질의 분석을 가능하게 합니다. 또한, 매트릭스 메탈로프로테나아제(12) 및 카테핀 S 활동은 전용 FRET프로브(22,23,24,25, 25,26)를통해 유사하게 조사할 수 있다. 1. 샘플 준비 : 세포 격리 및 상피 분리 참고: 가능하면 가래 처리는 예상 후 120분 이내에 수행되어야 하며 추가 처리가 있을 때까지 가래를 얼음에 보관해야 합니다. 가래의 자발적인 기대가 불가능한 경우, 이전에 설명된 바와 같이 가래를유도한다 19. 간단히, 가래 유도 절차를 시작하기 전에 β-2 수용체 길항제 살부타몰의 200 μg를 흡입한다. 그 후, 분무기를 사용하여 15 분 동안 고토닉 (6 %) 식염수 용액을 흡입하십시오. 페트리 요리로 기대되는 가래를 모으세요. 점액 덩어리를 타액에서 페트리 팁의 도움으로 페트리 접시에 분리합니다. 점액의 무게를 측정합니다.참고: 점액 샘플의 평균 중량은 0.8g(0.1g에서 5g 사이변화); 0.1 g는 일반적으로 언급 된 절차를 수행하기에 충분합니다. 가래에 10% 스푸톨리신(PBS)의 4개 부품(v/w)을 가래에 넣습니다(예: 가래 각 그램당 10% 스푸톨리신 4mL).주의: 스푸톨리신은 인산염 완충제에 농축 된 디티오스레이톨로 구성되어 있으므로 주의해서 처리하십시오. 점액을 용해하기 위해 15 분 동안 흔들 셰이커에 실온 (RT)에서 혼합물을 배양합니다. 안전상의 이유로 셰이커를 연기 후드에 넣습니다. 감기 PBS의 동일한 볼륨을 추가하여 반응을 담금질 (예를 들어: 10% Sputolysin의 각 mL에 대 한 차가운 PBS의 1 mL). 균일 한 용액을 얻기 위해 파이펫팅에 의해 혼합. 100 μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 혼합물을 50mL 튜브로 필터링합니다. 40 μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 여과 단계를 반복합니다. 원심 분리는 4 °C에서 300 x g에서 10 분 용용액을 제공합니다. 상체 분수를 신선한 튜브에 조심스럽게 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.참고: 상체 분획은 추가 분석이 될 때까지 -20°C 또는 -80°C로 저장할 수 있습니다. 차가운 PBS의 500 μL에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 얼음 위에 놓습니다.참고: 셀 분획은 즉시 처리해야 합니다. 2. 호중구 세린 프로테아제 활동 측정 참고: 여기에서는 FRET 리포터를 통해 NSP 활동을 정량화하기 위해 다양한 방법이 도입됩니다. 기술의 선택은 실험의 특정 생물 의학 질문 및 목적에 의해 결정된다. 제시된 프로브는 폐 관련 효소14,15세트에대한 특이성을 광범위하게 테스트하였다. 프로브는 표적 효소에 특이적이지만 항상 관심있는 임상 샘플에 대한 프로브 특이성을 확인하십시오. 이는 프로브 첨가 전에 특정 프로테아제 억제제로 시료를 배양함으로써 달성될 수 있으며, 이는 D/A 비율의 증가를 폐지해야 한다. 불소계 또는 플레이트 판독기를 통한 용해성 NSPs 활성 정량화참고: 시료의 수용성 분획에서프로테제 활성은 형광 검출이 가능한 모든 계측기에서 검출될 수 있다.얼음에 효소를 해동. 사용 전까지, NE와 CG를 산성 저장 버퍼(50mM 나트륨 아세테이트, 200m M M NaCl, pH 5.5)에 보관하여 자가 분열을 방지한다. 효소 표준 곡선을 설정하려면 활성화 버퍼(10m Tris-HCl, pH 7.5에서 500mM NaCl)에서 효소(NE용 33.9 – 0.271 nM, CG용 42.6 -0.333 nM)의 1:2 직렬 희석을 준비한다. 활성화 버퍼는 중립 pH를 가지므로 효소 촉매가 효율적으로 발생할 수 있습니다. 최고 표준 농도(NE 농도: 33.9nM)를 준비하려면 활성화 버퍼의 999μL에서 NE(33.9 μM)의 1μL을 희석한다. 두 번째 표준(NE 농도: 16.95 nM)을 준비하려면 제1 희석의 200 μL을 활성화 버퍼 200 μL과 혼합합니다. 나머지 1:2 희석을 준비하기 위해 그에 따라 진행합니다. 공백인 마지막 표준은 순수한 활성화 버퍼로 구성됩니다. 기술 중복 또는 삼중 의 측정을 권장합니다. 표준 및 샘플 준비 중에 바이알을 얼음 위에 유지하십시오. 표준 준비와 병행하여 가래 샘플을 활성화 버퍼에서 희석시. 프로테아제 활성을 평가하기 전에 인간 샘플을 희석하여 리포터 신호의 증가의 선형 범위(기증자/수용자 비율)에 남아 있습니다. 환자 샘플이 희석되지 않은 상태로 방치되면 절단이 신뢰할 수 있는 피팅을 위해 너무 빠르게 발생합니다. 건강한 기증자 가래는 CF와 COPD 환자에서 견본에 비교된 더 적은 액티브 한 proteases를 포함하기 때문에, 다른 희석은 일반적으로 능력을 발휘합니다 (건강한 가래 상수에 대한 1:10, COPD 또는 CF 환자의 가래 상응을 위한 1:20-500).참고: 농도가 알려지지 않은 시료에서 프로테아제 활성을 정량적으로 측정하려면 알려진 효소 농도를 가진 표준 곡선을 동일한 플레이트에서 이상적으로 병렬로 측정해야 합니다. 인간 가래에서 활성 효소의 농도는 표준 곡선으로 측정된 것과 함께 인간 가래 샘플에서 측정된 슬로프를 보보아 계산됩니다. 측정을 위해 샘플을 준비하기 전에 계측기를 설정합니다. NE FRET 프로브(NEmo-114)에대한 흥분 파장을 354nm로 설정하고, 검출 파장을 기증자의 경우 400nm로 설정하고 수용자에 대한 490 nm를 설정한다. CG FRET 프로브(sSAM15)에대한 흥분 파장을 405nm로 설정하고 방출을 485(기증자) 및 580nm(수용자)로 설정합니다. 40 μL의 샘플, 표준 또는 블랭크를 검정 96웰 반 영역 플레이트의 우물에 넣습니다. 기자(마스터 믹스에서 기자의 농도: 10 μM)를 포함하는 마스터 믹스를 준비하려면, 프로브 스톡(DMSO1mM) 1:100을 활성화 버퍼로 희석한다. 필요한 플레이트 웰 의 수를 10 μL x곱을 곱하여 필요한 마스터 믹스 볼륨을 준비합니다. NEmo-1 및 sSAM 리포터의 형광 측정을 위한 최적의 최종 농도(2 μM)에 도달하기 위해 각 웰(샘플, 표준 또는 공백의 40 μL 포함)에 마스터 믹스 10μL을 추가하고 판독을 시작합니다. 따라서 NEmo-1 및 sSAM 리포터는 수용성 호중구 엘라서아제 및 카테신 G 활성을 각각 모니터링합니다.참고: 시약 인젝터를 사용할 수 없는 경우 리포터가 샘플을 추가한 후 가능한 한 빨리 판독을 시작해야 합니다. 플레이트 판독기 측정을 시작하고 최소 20분 동안 또는 신호의 증가가 고원에 도달할 때까지 60-90초마다 기증자/수용률 증가를 기록합니다. 데이터가 내보내지면, 기증자 상대형형광단위(RFU)를 각 시간점 및 시료에 대한 수락자 RFU로 나누어 기증자/수락률(D/A 비율)을 계산합니다. 각 샘플의 D/A 비율 평균 및 표준 편차를 계산합니다. D/A 비율 변경의 선형 성장 내의 경사를 결정합니다. 경사는 FRET 프로브에 대한 효소 분열 속도의 지표입니다. 효소 표준에서 계산된 효소와 인간 샘플에서 유래된 선형 회귀 경사면을 피팅하여 가래에 활성 효소의 농도를 계산합니다. 형광계 또는 플레이트 판독기를 통한 멤브레인 바인딩 NSPs 활성 정량화 위에서 설명한 바와 같이 가래 세포를 분리합니다. PBS의 40 μL의 부피에서 3 x 104 셀을 다시 중단합니다. 플레이트 리더에 셀을 잘 추가합니다. 계측기를 설정합니다. 멤브레인 바운드 NE FRET 프로브(NEmo-214)를위한 흥분 파장을 405nm로 설정하고, 검출 파장을 기증자의 경우 485nm로 설정하고, 수용자에 대한 580 nm를 설정한다. 멤브레인 바운드 CG FRET 프로브(mSAM15)를위한 난초파장을 405nm로 설정하고, 방출을 485(기증자) 및 580nm(수용자)로 설정한다. 기자를 포함하는 마스터 믹스를 준비하기 위해, 활성화 버퍼에서 프로브 스톡을 10 μM의 농도로 희석. 필요한 플레이트 우물의 수를 10 μL X로 곱하여 필요한 마스터 믹스 부피를 준비한다. NEmo-2 및 mSAM 리포터의 형광 측정을 위한 최적의 최종 농도(2 μM)에 도달하기 위해 각 우물(시료, 표준 또는 빈 40μL 포함)에 마스터 믹스 10μL을 추가하고 판독을 시작합니다. 따라서 NEmo-2 및 mSAM 리포터는 멤브레인 결합 호중구 엘라서아제 및 카테프신 G 활성을 각각 모니터링합니다.참고: 세포 음성 제어는 예를 들어 NSP를 적극적으로 분비하지 않는 세포를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 3 x 104 백혈구 선조HL-60 의 분동 세포를 가진 기자의 인큐베이션은 유효한 분열 음성 제어를 나타낸다. 최소 20분 동안 또는 신호의 증가가 고원에 도달할 때까지 기증자/수용률의 기록적인 변화. 위에서 설명한 데이터를 분석합니다. 형광 현미경 검사를 통한 멤브레인 바인딩 NSPs 활동 측정분석해야 하는 조건 수를 결정합니다.참고: 각 가래 샘플 측정에 대해 추가 양수(PC) 및 음수(NC) 제어의 준비 및 분석이 권장됩니다. 각 측정에 대해 1.5mL 튜브에서 50 μL PBS의 부피로 3 x 104 가래 세포를 다시 중단합니다. 부정적인 대조군으로서, 특정 억제제(Sivelestat, 특정 NE 억제제, 또는 카테신 G 억제제 I, 특정 CG 억제제, 100 μM의 최종 농도)를 가진 가래 세포를 배양한다. RT에서 10 분 동안 배양하십시오. 양성 대조군으로서, 적절한 효소(340nM 또는 200 nM에서 각각)를 가진 가래 세포를 RT에서 10분 동안 배양한다. 각 튜브(양성 대조군 처리 세포, 음의 대조구 처리 세포 및 처리되지 않은 세포)에 FRET 리포터와 핵 얼룩(1:1000 최종 희석)을 함유한 PBS의 50μL을 추가하여 RT에서 10-20분 동안 2μM의 프로브 최종 농도에 도달합니다.중요: 핵 얼룩의 첨가는 FRET 프로브 채널을 사용하지 않고 관심있는 가래 세포를 검색할 수 있으므로 형광 현미경 이미징을 용이하게하므로 리포터 표백을 피할 수 있습니다. 또한 DNA 얼룩은 핵의 모양에 따라 가래 세포를 분할할 수 있습니다. 예를 들어, 호중구는 그들의 다중 형 핵에 의해 쉽게 식별 될 수있다. 또한 세포의 생존 가능성에 대한 추가 정보는 검색 할 수 있습니다 (더 세분화 된 핵을 가진 호중구는 살아있을 가능성이 더 높습니다).참고: 막 바인딩 하나 이외에, 인간 가래에서 DNA 결합 NE 또는 CG의 활성은 H-NE 및 H-CG, 세포외 DNA-연관 FRET프로브(27)를통해 동일한 방식으로 측정될 수 있다. 마스터 믹스를 준비할 때 H-NE 및 H-CG는 10 μM의 농도로 첨가하고 사이토스핀 및 슬라이드 준비 전에 가래로 배양할 수 있습니다. 세포외 DNA에 대한 D/A 비율 정량화는 NEmo-2 및 mSAM과 동일하게 진행되며, 세포외 DNA 응집체가 단일세포(27)대신 세분화되는 유일한 차이점이 있습니다. 얼음 차가운 PBS의 100 μL을 추가하여 반응을 담금질하고 얼음에 샘플을 전달합니다. Cytospin 현미경 슬라이드에 혼합물, 공기 건조, 얼음 차가운 메탄올 10% 10 분 동안 수정, 공기 건조 및 적절한 장착 매체와 마운트.참고: 현미경 슬라이드는 추가 분석이 끝날 때까지 최대 1개월 동안 어둠 속에서 4°C로 저장할 수 있습니다. PL APO 40x 또는 63배 오일 목표를 가진 공초점 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 획득합니다. 이미지 품질을 높이고 획득 시간을 줄이려면 순차적인 이미지 수집 모드를 권장합니다. 헬륨-네온 레이저 라인으로 633 nm 암분과 함께 핵 얼룩을 먼저 이미지하고 650에서 715 nm 사이의 방출을 기록합니다. 458 nm에서 아르곤 레이저로 470~510nm 사이 FRET 기자의 기증자(쿠마린 343)를 기록한다. 단독 기증자 여기 후 570에서 610 nm 사이의 감세 수용자 (5,6-TAMRA) 방출을 획득하십시오. 다이오드 펌핑 솔리드 스테이트(DPSS) 레이저를 이용하여 561nm에서 470~510nm 사이의 별도의 채널에서 직접 수용체 방출을 기록한다. 실험 의 시작 부분에 핀홀을 설정하고 이미징 세션 의 과정에서 유지 관리합니다.참고: 크기가 작기 때문에 40배 또는 63배 현미경 목표를 사용하면 호중구를 제대로 시각화하는 것이 좋습니다. 일반적으로 이미지는 수집 중에 리포터의 광표백을 방지하기 위해 더 긴 흥분 파장을 시작으로 여러 연속 채널에서 획득됩니다. 결정적인 통계를 위해 조건당 적어도 100개의 셀을 이미지. 현미경 이미지 분석의 경우 적절한 소프트웨어를 사용합니다: 세포를 분할하고 픽셀단위로 D/A 비율을 계산한 후 사용자가 수동으로 선택한 관심 영역의 평균 또는 중앙값을 계산합니다. 대표적인 결과는 그림 1을참조하십시오. 그림 1: CF 환자 가래로부터 분리된 호중구에 대한 멤브레인 바운드 NE 활성의 대표적인 영상 및 정량화. a)주중구의 대표적인 공초점 현미경 이미지 (상단 패널) 10 분 동안 Sivelestat (w/) 또는 왼쪽 치료되지 않은 (w/o) (하단 패널) 기자 NEmo-2 μ-2M 전에 왼쪽의 첫 번째 열은 핵 얼룩, 두 번째 기증자 채널, 세 번째 수락채널 및 기증자 및 수락자 채널을 픽셀단위로 나누어 얻은 마지막 계산된 D/A 비율을 나타낸다. 관심 영역(단일 호중구)의 경계는 파선선으로 묘사됩니다. 배율(10μm) 및 교정 막대(D/A 비율)가 표시됩니다. b)대표적인 CF 환자로부터 가래 호중구의 D/A 비율을 나타내는 상자 및 도트 플롯. 억제제 및 처리되지 않은 세포로 배양된 세포는 각각 회색과 파란색으로 표시됩니다. 각 점은 하나의 세포를 나타낸다(N: w/억제제 = 113 및 w/o 억제제 = 96). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 유동 세포측정을 통한 멤브레인 바인딩 NSP 활동 측정 5mL FACS 폴리스티렌 라운드 하단 튜브에서 PBS의 100 μL에 1 x 106 세포를 다시 중단하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 가래 호중구를 게이트하려면 CD14(1:50), CD16(1:50), CD45(1:33) 및 CD66b(1:50)를 사용한다. 모든 샘플에 대한 충분한 마스터 믹스를 준비합니다. 어둠 속에서 얼음에 마스터 믹스를 놓습니다. 도 2에설명된 대로 게이팅 전략을 설정합니다. 호중구는 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ 이벤트로 게이트됩니다. 게이트 이벤트는 기증자(λexc = 405 nm, λem = 450/50 nm) 및 수용자(λexc = 405 nm, λem = 585/42 nm)에 대한 막 바인딩 프로테아제 활성을 분석합니다. 각 샘플에 2 μL의 FcBlock을 추가하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 각 튜브에 선택한 항체를 추가하고 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 배양하십시오. 차가운 PBS2mL, 원심분리기는 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 세척합니다. 차가운 PBS의 200 μL에서 슈퍼 나tant를 버리고 세포를 다시 중단하십시오. 200 μL을 두 개의 튜브에 각각 100 μL로 분할하고 각 튜브에 5 μL의 세포 생존 성 스테인딩 솔루션을 추가합니다. 얼음 에 튜브를 배치합니다. 적절한 특정 NSP 억제제(NE 사용 시벨레스타트의 경우 225 μM 최종 농도) CG용 카테프신 G 억제제 I를 100 μM에서 음수 제어(NC) 테스트 튜브에 추가합니다. 어둠 속에서 10 분 동안 RT에서 샘플을 배양하십시오. 샘플에 차가운 PBS 100 μL을 추가하고 깨끗한 FACS 튜브의 40 μm 필터를 통해 필터링하여 기기의 막힘을 방지합니다. 기자(NE, NEmo-2의 최종 농도에서 4 μM, CG, mSAM의 최종 농도 2 μM)를 NC 샘플에 추가하여 튜브를 부드럽게 소용돌이시다. 필요한 경우 게이트뿐만 아니라 기자 PMTs의 전압을 약간 조정하기 위해 특정 억제제로 인큐베이션된 세포를 획득하기 시작합니다. 적어도 1000호중구를 기록합니다. 샘플을 실온에서 유지합니다.참고: 더 많은 이벤트를 기록할 수 있지만 1000개의 셀은 적절한 통계와 기록 시간 사이에 좋은 타협을 보장합니다. 그에 따라 다음 튜브(처리되지 않은 가래 샘플)를 진행합니다. 막 바인딩 프로테아제 활성으로 인한 D/A 비율의 변화를 기록하려면 각 튜브에서 5~10분마다 1000개의 호중구를 기록하십시오.참고 : 성공적인 FRET 기자 분열 후, 기증자 채널 MF의 강도는 시간이 지남에 따라 증가합니다. 수락채널 MF의 강도는 시간이 지남에 따라 감소하거나 일정하게 유지되어야 합니다. 게이트된 실행 가능한 단일 호중구에서 측정된 샘플에 대한 수락자 채널 값으로 기증자를 분할하여 FRET 비율을 계산합니다. 샘플 측정을 해당 0분 시간점으로 나누어 샘플 측정을 정규화합니다(대표 결과 및 분석은 그림 2참조).참고: D/A 비율 변경의 동적 측정을 위해서는 최소 두 시간 포인트(예: 0 및 10분)의 기록이 필요합니다. 각 샘플에 대한 활성 측정을 정상화하기 위해, 후기 시점에서 측정된 D/A 비율(예를 들어, 10분)은 프로브 추가 후 즉시 계산된 비율로 나뉩니다(0분). 그림 2: CF 환자 가래로부터 분리된 호중구에서 측정된 멤브레인 결합 NE 활성의 게이팅 전략 및 대표적인 플롯. a)게이트 가래 호중구에 다음 항체가 사용된다: CD14 (1:50), CD16 (1:50), CD45 (1:33) 및 CD66b (1:50). 호중구는 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ 이벤트로 게이트됩니다. 게이트 이벤트는 기증자(λexc= 405 nm, λem= 450/50 nm) 및 수용자(λexc= 405 nm, λem= 585/42 nm)에 대해 분석된다. b)그들의 막 바인딩 NE 활동을 위해 분석된 CF 가래 호중구의 대표적인 히스토그램. 왼쪽 열은 기증자 신호를 나타내고 오른쪽 열에는 수락자 신호가 표시됩니다. 맨 위 행은 리포터를 추가하기 전에 10 분 동안 Sivelestat (w/)로 처리 된 세포의 형광 강도를 의미합니다. 맨 아래 행은 기자가 추가한 후 즉시(0분, 회색) 및 10분(파란색)을 측정하는 처리되지 않은 세포를 보여줍니다. 호중구는 패널 a.c)에도시된 전략에 따라 게이트되어 있으며, 데이터 테이블은 여러 시간 지점(0-3-5-10-15-20분)에 걸쳐 측정된 호중구에 대한 기증자 및 수용자 신호에 대한 원시 MFIs및 수용자 신호로 구성된 대표적인 데이터 집합과 계산된 D/A 비율을 나타낸다. D/A 비율은 0분 시간 점(흰색 글꼴)으로 정규화될 수 있습니다. 0분은 기자가 스테인드 가래 세포를 가진 유동관에 추가한 후 가능한 한 빨리 수행된 기록을 나타냅니다. MFIs 데이터는 1000호중성구에 대한 표준 편차를 평균 ± 나타내고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.