嚢胞性線維症肺における 緑膿菌 および 黄色ブドウ球 菌バイオフィルムのEx生体モデルにおける抗生物質有効性試験
Summary
このワークフローは、嚢胞性線維症の個人の肺に細菌バイオフィルムの確立されたex vivoモデルを使用して抗生物質感受性試験を行うために使用することができる。このモデルの使用は、MBEC(最小バイオフィルム根絶濃度)アッセイの臨床有効性を高めることができる。
Abstract
嚢胞性線維症(CF)を有する個人の肺内に存在する細菌バイオフィルムに対する抗生物質の効果的な処方は、標準的な診断方法(例えば、ブロス微小希釈、ディスク拡散、またはEtest)および抗生物質治療後の臨床結果との間の不十分な相関関係によって制限される。既製のバイオフィルム成長プラットフォームを使用してASTを改善する試みは、結果の改善をほとんど示さない。インビトロバイオフィルムシステムの限られた能力は、CF肺の生理化学的環境を模倣し、したがって細菌生理学およびバイオフィルムアーキテクチャは、CF感染のための新しい治療法の発見のブレーキとしても機能する。ここでは、ブタ気管支組織と合成CF痰(ex vivo pig肺、EVPL)で構成されるex vivo CF肺モデルにおいて、成熟したCF病原体のASTを実施するプロトコルを提示する。
バイオフィルム感受性試験には、標準的な実験室媒体またはマイクロチタープレートの合成CF痰の様々な製剤を使用して、いくつかのインビトロアッセイが存在します。成長培地とバイオフィルム基材(ポリスチレンプレート対気管支組織)の両方がバイオフィルム抗生物質耐性に影響を与える可能性があります。我々は、ex vivoモデルにおける臨床的 な緑膿菌 および 黄色ブドウ球菌 分離株の耐性の強化を示す。バイオフィルムの抗生物質治療の効果は、標準的なマイクロ希釈アッセイにおける最小阻害濃度(MIC)またはディスク拡散アッセイにおける感受性/耐性分類と相関していない。
ex vivoプラットフォームは、患者サンプルのオーダーメイドバイオフィルムASTや、医薬品の研究開発中に潜在的な抗バイオフィルム剤の強化されたテストプラットフォームとして使用できます。より多くの生体内のようなテストプラットフォームを使用して抗バイオフィルム創薬の処方または加速を改善することは、CFを持つ個人の健康結果を大幅に改善し、臨床治療および発見研究のコストを削減する可能性があります。
Introduction
慢性バイオフィルム感染は、正常な免疫防御が損なわれる個人に影響を与える。危険にさらされているグループには、嚢胞性線維症(CF)1の遺伝的状態を有するものが含まれる。乳児期初期に気道内で異常に厚く粘液が形成されたコロニー形成は、気管支2,3の難治性バイオフィルム感染を招く。広範なマトリックスカプセル化バイオフィルムとしての細菌の増殖は、免疫不全患者の慢性感染を健康な宿主の急性感染と区別する1つの要因であり、バイオフィルム状態は共に抗生物質暴露から細菌を保護し(マトリックスを通した拡散の減少による)、抗生物質の感受性を低下させる(例えば、静止の誘導または流出ポンプのアップレギュレーションを通じて)しかし、宿主組織生理学および化学における疾患特異的変化は、急性感染または標準的な実験室の成長条件で観察された細菌生理学をさらに変化させる。CFの主な例としては、肺界面活性剤から放出される脂肪酸やアミノ酸などの異常な炭素源の使用、およびムチンの微生物分解によって産生される、損傷した組織からの鉄などの微量栄養素の放出、および微小空気ビオシス6、7、8が含まれる。
したがって、特定のバイオフィルム感染コンテキストにおける特定の物理化学的条件は、抗生物質に対する応答に影響を与える可能性があります。まず、細胞外マトリックスの構造と深さは、栄養素やせん断力などの局所的な環境条件に依存します。第二に、環境の手がかりは、特定の抗生物質耐性遺伝子の発現を引き起こす可能性がある。例えば、CF病原体シュードモナス・エルギノーサは、β-ラクタマーゼの発現の増加と、CF痰対インビトロ9におけるポリンの発現の減少を示し、一方、別のCF病原体であるバークホルデリア・セノセパシアは、CF痰10で増殖した場合にβ-ラクタマーゼおよび流出ポンプをアップレジュレーションする。第三に、宿主内の状態は、インビトロで再現するのが難しい抗生物質耐性型への生理学的または遺伝的切り替えをキューに入れることができます。これらには、CF病原体黄色ブドウ球菌11,12の小コロニー変異体が含まれる。
これらのデータはすべて、診断ラボが個々のクローンを病原性バイオフィルムから分離し、標準的な実験室メディア(ブロスマイクロ希釈、ディスク拡散またはEtest)でプランクトンまたは寒天プレート栽培培養物にASTを実行する場合、結果は実際に生体内で働く抗生物質を予測しないことが多いことを示しています。インビトロバイオフィルムアッセイが使用されている場合でも、使用される媒体と付着面の違いのために生体様バイオフィルム表現型をキューに入れることができない可能性があるため、フローセルまたはハイスループットマイクロプレートプラットフォームを使用したアッセイは、抗生物質感受性13を過大評価することができる。フローセル、マイクロタイタープレート、疾病管理バイオフィルム反応器センターなどのインビトロプラットフォームを使用して薬物ポテンシャルをテストし、バイオフィルム有効性バーを低く設定し、研究、開発パイプラインで偽陽性を生み出す可能性があります。
CFにおける抗生物質治療後のAST結果と臨床結果との間の相関が低いことはよく知られている。多くの臨床医は、これらの結果を解釈するための統一されたCF固有のガイドラインがないため、診断ラボASTを無視するだけで、処方のためのケースバイケースの意思決定を行います。カルガリーバイオフィルム装置を使用してCF ASTを改善する試みがなされており、標準的なAST培地(例えば、カチオン調整されたミュラー・ヒントン・ブロス)14,15を含むマイクロプレートのウェル内にセットされたプラスチックペグの表面に成長したバイオフィルムを使用する。このアッセイは、標準的なプランクトニックAST16よりも、どの抗生物質が生体内で働くかを予測するのに適していません。CF患者への影響は明らかです。抗生物質投与を繰り返す(定期的な吸入抗生物質と英国のCFを持つ個人のための静脈内抗生物質を受け取る27日/年の中央値)にもかかわらず、急性肺増悪の頻繁かつ予測不可能なエピソードは進行性肺損傷をもたらし、症例の約90%では呼吸不全による死亡を引き起こす。最近の分析では、細菌性肺感染症はCFの投薬コストの最も強力な予測者であり、平均€3.6K/患者/年を追加して医療費18,19を指示した。
それ以外の健康な個人の急性感染に関しては、例えば、ポイント・オブ・ケアゲノム予測に基づく急速なASTに焦点を当てた現在の研究および政策は理想的である20である。しかし、慢性CF感染の場合、インビボ環境と病原体代謝状態をよりよく再現し、現実的なバイオフィルム構造の形成を可能にするホスト模倣モデルにおけるASTの実装という、異なるアプローチが必要であることは明らかです。
我々は以前に、合成CF痰でインキュベートされ、P.緑内科またはS.アウレウスに感染したブタ気管支のセクションで構成されるCFバイオフィルムモデルを開発した。未感染のEVPLは、7日間正常な組織病理学を保持するが、P.緑内膜およびS.アウレウスのラボまたは臨床分離株は、組織の周りの生体様凝集体で再現的に形成され、CF感染21、22、23の病因を模倣する。この高妥当性、ハイスループットモデルをCF用の合わせたバイオフィルムASTプラットフォームとして使用するためのプロトコルを提示し、モデルで成長させたときに臨床用抗生物質に対する病原体バイオフィルムの高い耐性を示す例示的な結果を提示する。このモデルは、バイオフィルム形成の管理または予防のための研究、開発パイプラインに容易に組み込むことができ、診断ASTに組み込まれる可能性があります。使用されるほとんどの機器(材料表を参照)は、ビーズビーターが不可欠であるが、典型的な微生物学の実験室で容易に見つけることができますが、我々は適切な紫外線殺菌キャビネットも調達する必要があるかもしれないことを共同研究者との研究から発見しました。肺は商業肉屋やアバトワールから供給されるため、このモデルは倫理的な懸念を示さない。
Protocol
Representative Results
Discussion
ex vivo肺モデルは高いスループットと安価であり、食肉産業からの消費者後の廃棄物を使用するため、倫理的な懸念はありません。これは、現在利用可能な体外ASTプラットフォームよりも優れた慢性的に感染したヒトCF気道を模倣するように設計されています。ここで示された結果は、このような状況下での抗生物質感受性をより正確に予測する可能性があることを示している。
プロトコルの重要な手順は、信頼性が高く、再現性のある結果を保証します。
- 肺サンプルの屠殺、採取、処理の間に一貫した時間と貯蔵方法を使用します。殺処分後できるだけ早く肺を使用し、汚染の可能性を最小限に抑えることも重要です。可能な限り新鮮でない場合、実験培養物が肺で成長する能力の違いが観察されている。
- SCFMの産生における無菌性の維持および肺部分の解剖は必須である。健康な肺は無菌ではないので、コメンサルバクテリアの存在は慢性感染のための「自然な」環境を反映している可能性があります。それにもかかわらず、前述のように、多種集団内の細菌相互作用は、結果および抗生物質に対する感受性を変える可能性があるため、汚染は避けるべきであり、肺は使用前に滅菌されるべきである。我々は、スズ組織の完全性の変化を引き起こさないように見え、必要に応じて追加の抗生物質の使用を提唱する。しかし、抗生物質は選択的圧力を導入して結果に影響を与え、試験細菌集団の遺伝子発現を変化させる可能性があるため、注意して使用する必要があります。
- 非選択的で豊富な培地上で増殖した模擬感染、陰性対照組織サンプルおよび細胞カウントプレートを使用して、滅菌中に除去されていない汚染物質または同位細菌の増殖を強調する。これは、ASTにこれらの細菌の影響を軽減するために不可欠です.また、重複プレートがコロニー同定と細胞列挙をスピードアップするので、目的の生物に固有の重複した選択的寒天、細胞数プレートを生成することも有用である。
- 最初にモデルを使用する場合、および新しい株または細菌の遺伝子型で使用して組織切片間のバイオフィルムCFU変動を評価する場合にパイロット実験を行い、電力計算を使用して最適な実験サンプルサイズ(例えば、複製肺の数から取得する反復組織切片の数)を選択できるようにします。
- このアッセイは非標準化接種を使用し、48時間のインキュベーション後の急速な接種と比較的一貫したバイオフィルム負荷の形成(特に P.緑素吸砂の場合)を可能にする。初期のバイオフィルム増殖段階で抗菌効果をアッセイするために、ASMに懸濁したコロニー成長細菌の標準化されたCFUを接種することを検討する。我々は、プランクトニック細菌を接種することはお勧めしません:初期のパイロット実験は、これが信頼性の高いバイオフィルム形成ではなく、急性、侵襲的な成長につながることを示しました。
このプロトコルは 、P.aeruginosaで使用するための堅牢なプロトタイプモデルを生成し 、S.アウレウスで使用するための開発のための大きな可能性を持っていますが、将来的に特定のアプリケーションに対処する必要があるいくつかの制限があります。組織は、クローン集団の開発を可能にするために、単一のコロニーから接種された。結果は 、P.緑分化症の場合、これは48時間の細胞数にほとんど影響を与えかからずであることを示している。しかし 、S.アウレウス に対して細菌負荷の変動性が大きく認められ、異なる細菌がモデル内で異なる成長を生じる可能性があることを考えると、標準化された開始接種および同一の大きさと重量の組織サンプルの厳格な生産は、研究の生物に依存する可能性がある。また、正確な解剖/感染技術や地元の豚の品種/陸上の違いのために、ラボ間の違いがあるかもしれません。モデルの個々の実装に対する細菌集団の再現性を評価するために、結果25 の統計解析の一部として反復性計算を使用し、パイロット実験に基づく反復性/電力計算を使用して、最終実験で使用する最適なサンプルサイズを計算することを提案する。
従来のプレートアッセイに比べてEVPLの主な利点の1つは、プランクトン的または非生物的表面上で増殖する細菌を試験するのではなく、宿主環境内および細胞分化で細菌バイオフィルムの空間構造を可能にすることです。これは、抗菌剤の活性に及ぼす生理化学的および栄養勾配の影響、ならびに慢性感染および細菌間の細胞間相互作用における異なる微小環境における活性療法の送達および利用可能性を考慮する上で重要な意味を持つ。この後者の点は、CFで多種感染が日常的に観察され、喘息や慢性閉塞性肺疾患などの他の呼吸器疾患に関連する感染症にとってますます重要になっているため、特に重要である。臨床診断における個別の患者痰のサンプリングのためのASTのためのこのモデルを開発する可能性がある。慢性創傷による創傷模倣インビトロモデルと、慢性創傷からの破片バイオフィルムのAST(テキサス州ラボックのサウスウエスト地域創傷ケアセンター、R.ウォルコット博士)を使用して、同様の試験がすでに進行中です。
さらに、モデルは死後の組織を使用するので、宿主の免疫応答が抗生物質感受性に及ぼす影響は限られている。現在のin vitroモデルは、ホストの免疫応答も考慮していないので、ASTアプリケーションにおけるモデルの将来の使用の障壁としては考えていない。しかし、薬物動態および薬力学パラメータおよび抗生物質投与ガイドラインが決定される場合には、免疫応答が考慮される。我々の研究は、組織23 内の残留免疫細胞および応答の証拠を示しているが(およびS.アジミ、個人的なコミュニケーション)、これはインビボ条件に対するより大きな一致が望まれるならば、モデルのさらなる最適化および開発のための主要な領域である。
CFに対してより臨床的に有効なASTを提供することは、「慎重な処方と抗菌スチュワードシップを確保するための手順が整われるべきである」という英国の健康、ソーシャルケア法2008の重要な勧告を満たすのに役立ちます。EVPLは、このニーズを満たすのに理想的な候補モデルであると考えています。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、模範的な結果を得た元の論文に関する私たちの共同執筆者のすべてに感謝します。この作品は、FHに授与されたMRC新調査官研究助成金(助成金番号 MR/R001898/1)によって資金提供されました。BBSRCミッドランズ統合バイオサイエンストレーニングパートナーシップ(MIBTP)の博士課程の学生がNEHとIAに授与した。そして、夏休みの研究プロジェクトを実施するためにFAにワーウィック大学学部研究支援スキームの賞によって.私たちは、スティーブ・クイグリー、サンズ(カビントン、ウォリックシャー)とジョン・テイラー、息子(アールズデン、コベントリー)が肺を供給してくれたことに感謝します。また、ウォリック大学生命科学部のメディア準備施設の助けを借りて、セリス・ハリーズとキャロライン・スチュワートに特別な感謝を、ワーウィック抗菌スクリーニング施設のアニタ・キャサウッドの助けを借りて認めたいと思います。
Materials
| 0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
| 24-well culture plates | |||
| 70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
| Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
| Agarose | |||
| Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
| Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
| Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
| Bunsen burner | |||
| Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
| Coolbox to transport lungs to lab | |||
| Dissection scissors in different sizes | |||
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
| Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
| Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
| Germicidal UV cabinet | |||
| Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
| Large pallet knife | |||
| LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
| Mounted razor blades | |||
| Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
| Petri dishes | |||
| Phosphate-buffered saline | |||
| Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
| SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
| Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
| Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
| Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |
References
- Elborn, J. S. Cystic fibrosis. The Lancet. 388 (10059), 2519-2531 (2016).
- Høiby, N., et al. Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients. APMIS. 125, 339-343 (2017).
- Bjarnsholt, T., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatric Pulmonology. 44 (6), 547-558 (2009).
- Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Penesyan, A., Gillings, M., Paulsen, I. Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities. Molecules. 20 (4), 5286 (2015).
- Son, M. S., Matthews, W. J., Kang, Y., Nguyen, D. T., Hoang, T. T. In vivo evidence of Pseudomonas aeruginosa nutrient Acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients. Infection and Immunity. 75 (11), 5313-5324 (2007).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Stites, S. W., Plautz, M. W., Bailey, K., O’Brien-Ladner, A. R., Wesselius, L. J. Increased concentrations of iron and isoferritins in the lower respiratory tract of patients with stable cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (3), 796-801 (1999).
- Cornforth, D. M., et al. Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5125-5134 (2018).
- Drevinek, P., et al. Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum. BMC Infectious Diseases. 8, 121 (2008).
- Goerke, C., Wolz, C. Regulatory and genomic plasticity of Staphylococcus aureus during persistent colonization and infection. International Journal of Medical Microbiology. 294 (2-3), 195-202 (2004).
- Wolter, D. J., et al. Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis. Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).
- Roberts, A. E. L., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427, 3646-3661 (2015).
- Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology. 37 (6), 1771-1776 (1999).
- Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J., Burns, J. L. Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1915-1922 (2004).
- Smith, S., Waters, V., Jahnke, N., Ratjen, F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), (2020).
- Trust, C. F. . Annual Data Report 2019. , (2019).
- Angelis, A., et al. Social and economic costs and health-related quality of life in non-institutionalised patients with cystic fibrosis in the United Kingdom. BMC Health Services Research. 15 (1), 428 (2015).
- Eidt-Koch, D., Wagner, T. O. F., Mittendorf, T., von der Schulenburg, J. M. G. Outpatient medication costs of patients with cystic fibrosis in Germany. Applied Health Economics and Health Policy. 8 (2), 111-118 (2010).
- Harrington, N. E., Sweeney, E., Harrison, F. Building a better biofilm – Formation of in vivo-like biofilm structures by Pseudomonas aeruginosa in a porcine model of cystic fibrosis lung infection. Biofilm. 2, 100024 (2020).
- Harrison, F., Diggle, S. An ex vivo lung model to study bronchioles infected with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbiology. 162, 1755-1760 (2016).
- Sweeney, E., et al. An ex vivo cystic fibrosis model recapitulates key clinical aspects of chronic Staphylococcus aureus infection. Microbiology. , (2020).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: A practical guide for biologists. Biological Reviews. 85 (4), 935-956 (2010).
- Sweeney, E., Sabnis, A., Edwards, A. M., Harrison, F. Effect of host-mimicking medium and biofilm growth on the ability of colistin to kill Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 166 (12), 1171-1180 (2020).
- Stalker, D. J., Jungbluth, G. L., Hopkins, N. K., Batts, D. H. Pharmacokinetics and tolerance of single- and multiple-dose oral or intravenous linezolid, an oxazolidinone antibiotic, in healthy volunteers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (5), 1239-1246 (2003).
- Ager, S., Gould, K. Clinical update on linezolid in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Infection and Drug Resistance. 5, 87-102 (2012).
- Kirchner, S., et al. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
