Summary

Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und Mesenchym/Bindegewebe von embryonalen 12,5 und 8 Wochen alten Mäusen

Published: January 21, 2021
doi:

Summary

Wir haben ein verallgemeinertes Protokoll entwickelt, um eine große Menge hochwertiger Einzelzellen aus dem Epithel und Mesenchym/Bindegewebe embryonaler und erwachsener Mauszungen zu dissoziieren.

Abstract

Die Zelldissoziation war ein wesentliches Verfahren für Studien auf Einzelzellebene und/oder auf Zellpopulationsebene (z. B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und primäre Zellkultur). Die Gewinnung lebensfähiger, gesunder Zellen in großen Mengen ist von entscheidender Bedeutung, und die optimalen Bedingungen dafür sind vom Gewebe abhängig. Zellpopulationen im Zungenepithel und im darunter liegenden Mesenchym/Bindegewebe sind heterogen und die Gewebestrukturen variieren in verschiedenen Regionen und in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Wir haben Protokolle zur Isolierung von Zellen aus dem Zungenepithel der Maus und Mesenchym/Bindegewebe in den frühen Entwicklungsstadien [Embryonaltag 12,5 (E12,5)] und jungen Erwachsenen (8 Wochen) getestet. Eine saubere Trennung zwischen dem Epithel und dem darunter liegenden Mesenchym/Bindegewebe war leicht zu bewerkstelligen. Um Zellen weiter zu verarbeiten und zu isolieren, sind jedoch lebensfähige gesunde Zellen in großen Mengen und die sorgfältige Auswahl des enzymatischen Verdauungspuffers, der Inkubationszeit und der Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit von entscheidender Bedeutung. Die Inkubation von getrenntem Epithel oder darunterliegendem Mesenchym/Bindegewebe in 0,25% Trypsin-EDTA für 30 min bei 37 °C, gefolgt von zentrifugation bei 200 x g für 8 min führte zu einer hohen Zellausbeute bei einer hohen Lebensfähigkeitsrate (>90%) unabhängig von den Mausstadien und Zungenregionen. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass sowohl dissoziierte epitheliale als auch mesenchymale/Bindegewebszellen aus embryonalen und adulten Zungen im zellkulturbasierten Medium mindestens 3 h überleben konnten, ohne dass die Zelllebensfähigkeit signifikant verringert wurde. Die Protokolle werden für Studien nützlich sein, die die Herstellung isolierter Zellen aus Mauszungen in frühen Entwicklungsstadien (E12.5) und jungen Erwachsenen (8 Wochen) erfordern, die eine Zelldissoziation aus verschiedenen Gewebekompartimenten erfordern.

Introduction

Die Säugetierzunge ist ein komplexes Organ, das für Geschmack, Sprechen und Lebensmittelverarbeitung entscheidend ist. Es besteht aus mehreren Arten von hochorganisierten Geweben, die durch Mesenchym / Bindegewebe unterteilt und von einem geschichteten Epithelblatt bedeckt sind, das Geschmackspapillen und Geschmacksknospen enthält. Zellpopulationen sowohl im Zungenepithel als auch im Mesenchym/Bindegewebe sind heterogen. Um die Funktionen und die Verteilung eines bestimmten Zelltyps in der Zunge besser zu verstehen, sind Studien mit dissoziierten Zellen notwendig. Zum Beispiel ist die Einzelzell-RNA-Sequenzierung eine leistungsfähige und hochdurchsatzartige Methode zur transkriptomischen Profilierung in einzelnen Zellen, die entwickelt wurde, um das Transkriptom komplexer Gewebe mit einer Einzelzellauflösung1,2,3,4zu verstehen. Die primäre Zellkultur hat sich als nützliches Werkzeug erwiesen, um die Funktion und Differenzierung von Stamm-/Vorläuferzellen für Geschmacksknospen zu untersuchen5,6. Diese Studien erfordern eine große Menge an qualitativ hochwertigen isolierten Zellpopulationen (z. B. ausreichende Gesamtzellzahl bei richtiger Konzentration und hoher Lebensfähigkeit).

Daher besteht die Notwendigkeit, Zellen aus verschiedenen Regionen des Lingualgewebes und in verschiedenen Entwicklungsstadien zu isolieren. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Zelldissoziation vom Zungenepithel und dem darunter liegenden Mesenchym / Bindegewebe. Hier berichten wir über eine optimierte Zelldissoziationsmethode, um Zellen für Experimente vorzubereiten, die eine hohe Qualität lebender Zellen erfordern, z. B. für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung und primäre Stammzellkulturen. Wir fanden heraus, dass die Auswahl des enzymatischen Aufschlusspuffers, das sanfte Pipettieren, die Auswahl des Resuspensionsmediums und die optimale Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit entscheidend sind, um diese großen Mengen hochwertiger Zellen zu erzeugen.

Protocol

Die Verwendung von Tieren (C57BL / 6-Mäuse während der gesamten Studie) wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Georgia genehmigt und entsprach den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Tieren für die Forschung. 1. Verwendung durch Tiere HINWEIS: Mäuse wurden in der Tiereinrichtung der Abteilung für Tier- und Milchwissenschaften an der University of Georgia bei 22 ° C unter 12-Stunden-Tag…

Representative Results

Trennung des Zungenepithels vom darunter liegenden Mesenchym/BindegewebeIn der embryonalen Mauszunge ist nach der richtigen Enzymverdauung eine Lücke im subepithelialen Raum sichtbar. Epithelblätter einiger Zungen werden während der Inkubation ohne mechanische Kraft getrennt. Bei der erwachsenen Mauszunge wird eine erfolgreiche Enzyminjektion durch die Schwellung in den injizierten Bereichen angezeigt (Abbildung 1B2</stro…

Discussion

Bisher gibt es kein detailliertes Protokoll für die Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und dem darunter liegenden Mesenchym/ Bindegewebe. Dieses aktuelle Zelldissoziationsprotokoll bietet ein reproduzierbares Verfahren, um eine Einzelzellsuspension mit einer hohen Zelllebensfähigkeit (>90%) aus Mauszungengewebe, einschließlich Epithelblättern und Mesenchym-/Bindegewebe sowohl im embryonalen als auch im postnatalen Stadium, obwohl isolierte Zellen von E12.5 und erwachsenen Mäusen unterschiedlich groß sind. Zum B…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01DC012308 und R21DC018089 an HXL unterstützt. Wir danken Brett Marshall (University of Georgia, Athens, GA) und Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) für technische Unterstützung und Beratung bezüglich der Zelldissoziation; an Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athens, GA) für englische Bearbeitung.

Materials

bovine serum albumin (BSA) Gold Biotechnology A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J) The Jackson Laboratory 000664
collagenase (Collagenase A) Sigma-Aldrich 10103586001
culture dish (35 mm in diameter) Genesee Scientific 32-103G
culture dish (100 mm in diameter) Genesee Scientific 32-107G
dispase (Dispase II) Sigma-Aldrich 04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors) Find Science Tool 91460-11
DMEM/F12 Gibco 11320033
fetal bovine serum (FBS) Hyclone C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps) Find Science Tool 11293-00
hemocytometer Hausser Scientific 3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) Life Technologies AMEX1000
low retention pipette tips METTLER TOLEDO 17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors) Fine Science Tool 15800-01
plastic warp VWR 46610-056
spatula (Moria Spoon) Fine Science Tool 10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) Fine Science Tool 11223-20
Trypan blue Gibco 15250061
Tyrode’s solution Sigma-Aldrich T2145-10L made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA Gibco 25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) Hoefer 33946 made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter Genesee Scientific 25-243
70% ethanol Koptec 233919 made from 100% ethanol
1-mL syringe BD 8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube Eppendorf 30122348
30-G needle BD 9193532
35-μm cell strainer Falcon 64750
70-μm cell strainer Falcon 64752

References

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Cite This Article
Yu, W., Ishan, M., Wang, Z., Liu, H. Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice. J. Vis. Exp. (167), e62163, doi:10.3791/62163 (2021).

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