Dissociation cellulaire de l’épithélium de la langue et du mesenchyme/tissu conjonctif des souris embryonnaires de 12,5 et de 8 semaines
Summary
Nous avons développé un protocole généralisé pour dissocier une grande quantité de cellules simples de haute qualité de l’épithélium et du mesenchyme/tissu conjonctif des langues embryonnaires et adultes de souris.
Abstract
La dissociation cellulaire a été une procédure essentielle pour les études au niveau de chaque cellule et/ou au niveau de la population cellulaire (p. ex. séquençage de l’ARN unicellulaire et culture cellulaire primaire). Il est essentiel de produire des cellules viables et saines en grande quantité, et les conditions optimales pour le faire dépendent des tissus. Les populations cellulaires dans l’épithélium de la langue et le mesenchyme/tissu conjonctif sous-jacent sont hétérogènes et les structures tissulaires varient selon les régions et à différents stades de développement. Nous avons testé des protocoles pour isoler des cellules de l’épithélium de langue de souris et du mesenchyme/tissu conjonctif aux stades de développement précoce [jour embryonnaire 12.5 (E12.5)] et de jeune adulte (8 semaines). Une séparation propre entre l’épithélium et le mesenchyme/tissu conjonctif fondamentaux était facile à accomplir. Cependant, pour traiter et isoler davantage les cellules, il est essentiel de produire des cellules saines viables en grande quantité et de sélectionner soigneusement le tampon de digestion enzymatique, le temps d’incubation et la vitesse et le temps de centrifugation. L’incubation de l’épithélium séparé ou du mésenchyme/tissu conjonctif sous-jacent dans 0,25 % de Trypsine-EDTA pendant 30 min à 37 °C, suivie d’une centrifugation à 200 x g pendant 8 min a donné un rendement élevé de cellules à un taux de viabilité élevé (>90 %) quels que soient les stades de la souris et les régions de la langue. D’ailleurs, nous avons constaté que les cellules épithéliales dissociées et mesenchymal/conjonctif de tissu des langues embryonnaires et adultes pourraient survivre dans le milieu basé sur la culture cellulaire pendant au moins 3 h sans diminution significative de viabilité cellulaire. Les protocoles seront utiles pour les études qui nécessitent la préparation de cellules isolées à partir de langues de souris à des stades de développement précoce (E12.5) et de jeune adulte (8 semaines) nécessitant une dissociation cellulaire de différents compartiments tissulaires.
Introduction
La langue des mammifères est un organe complexe essentiel pour le goût, la parole et la transformation des aliments. Il est composé de plusieurs types de tissus fortement organisés compartimentés par le mesenchyme/tissu conjonctif et recouverts d’une feuille épithéliale stratifiée contenant des papilles gustatives et des papilles gustatives. Les populations de cellules dans l’épithélium de langue et le mesenchyme/tissu conjonctif sont hétérogènes. Pour mieux comprendre les fonctions et la distribution d’un type particulier de cellules dans la langue, des études utilisant des cellules dissociées sont nécessaires. Par exemple, le séquençage de l’ARN unicellulaire est une méthode puissante et à haut débit pour le profilage transcriptomique dans des cellules individuelles, qui est conçue pour comprendre le transcriptome de tissus complexes à une résolution unicellulaire1,2,3,4. La culture cellulaire primaire s’est avérée être un outil utile pour étudier la fonction et la différenciation des cellules souches/progénitrices pour les papillesgustatives 5,6. Ces études nécessitent une grande quantité de populations de cellules isolées de haute qualité (p. ex. nombre total de cellules suffisant avec une concentration appropriée et une viabilité élevée).
Ainsi, il est nécessaire d’isoler les cellules de différentes régions des tissus linguaux et à différents stades de développement. Actuellement, il n’y a pas de protocole détaillé disponible pour la dissociation de cellules de l’épithélium de langue et du mesenchyme/tissu conjonctif sous-jacent. Ici, nous rapportons une méthode de dissociation cellulaire optimisée pour préparer les cellules à des expériences nécessitant une haute qualité de cellules vivantes telles que pour le séquençage de l’ARN unicellulaire et les cultures de cellules souches primaires. Nous avons constaté que la sélection du tampon de digestion enzymatique, le pipetage doux, la sélection du milieu de remise en suspension et le temps et la vitesse de centrifugation optimaux sont cruciaux pour générer ces grandes quantités de cellules de haute qualité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jusqu’ici, il n’y a pas eu de protocole détaillé disponible pour la dissociation de cellules de l’épithélium de langue et du mesenchyme/tissu conjonctif fondamentaux. Ce protocole actuel de dissociation cellulaire fournit une procédure reproductible pour générer une suspension cellulaire unique avec une viabilité cellulaire élevée (>90%) des tissus de langue de souris, y compris les feuilles épithéliales et les tissus mésenchymes/conjonctifs aux stades embryonnaire et postnatal, même si les cellules i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health, sous les numéros de subvention R01DC012308 et R21DC018089 à HXL. Nous remercions Brett Marshall (Université de Géorgie, Athènes, GA) et Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) pour l’assistance technique et la consultation concernant la dissociation cellulaire; à Francisca Gibson Burnley (Université de Géorgie, Athènes, GA) pour l’édition anglaise.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
