Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Toutes les méthodes décrites ici à l’aide de poissons-zèbres sont couvertes par le protocole animal du Dr Kristen Kwan, « Mécanismes cellulaires et moléculaires du développement du système visuel chez le poisson-zèbre », et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Utah. 1. Synthèse d’ARN plafonnée Générer le modèle d’ADN pour la transcription in vitro. Linéariser le gabarit d’ADN en digérant 10 μg d’ADN dans un volume de 100 μL du mélange réactionnel. Une réaction typique est assemblée comme suit: digérer 10 μg d’ADN en utilisant 3 μL d’enzyme et 10 μL de tampon, porter le volume de réaction à 100 μL avec de l’eau.REMARQUE: Un modèle typique pour la digestion est un vecteur pCS2, par exemple, pCS2-EGFP-CAAX ou pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry pour le marquage de la membrane et de la chromatine décrits ici. Dans ce cas, les ADN plasmidiques sont chacun digérés à l’aide de l’enzyme NotI. Les utilisateurs doivent se méfier de l’activité des étoiles; dans ce cas, une enzyme haute fidélité est recommandée et disponible dans le commerce. Incuber la réaction à 37 °C pendant la nuit pour s’assurer que l’ADN est digéré jusqu’à la fin. Nettoyez le digest de restriction à l’aide d’un kit de purification PAR PCR en suivant le protocole du fabricant. Éluez l’ADN avec 30 μL ddH2O. Stockez l’ADN linéarisé à -20 °C et utilisez-le au besoin.REMARQUE: La quantité d’ADN digérée et le volume d’élution donnent environ 0,3 μg / μL; ceci est suffisant pour ~5 tours de transcription in vitro, chaque tour utilisant ~2 μg d’ADN comme modèle. Transcrire in vitro l’ARN coiffé à l’aide d’un kit de transcription in vitro. Pour les modèles pCS2 (comme décrit ici), utilisez un kit SP6. Assemblez la réaction de transcription in vitro, comme suit: Digérer 2 μg de gabarit d’ADN ou jusqu’à 6 μL avec 2 μL de 10x tampon de réaction, 10 μL de 2x mélange de ribonucléotide et 2 μL de 10x mélange d’enzymes. Incuber à 37 °C pendant 2 à 4 h ou plus (des temps plus longs entraîneront un rendement plus élevé). Si vous le souhaitez, 1 μL d’Enzyme Mix peut être complété à mi-chemin de la période d’incubation. Digérer le gabarit d’ADN en ajoutant 1 μL de DNase sans RNase et en incubant pendant 15 min à 37 °C. Purifier l’ARN coiffé à l’aide d’un kit de purification de l’ARN suivant le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux). Éluez avec 100 μL deH2Osans RNase.REMARQUE: L’ajout de β-mercaptoéthanol n’est pas nécessaire pour cette application. Bien que la méthode décrite dans ce protocole soit simple, d’autres réactifs peuvent également être utilisés pour purifier l’ARN. Précipiter l’ARN. Ajouter 10 μL de NaOAc sans RNase de 3 M et 2,5 volumes (~275 μL) d’ETOH glacé sans RNase à 100 % à l’ARN élué. Incuber la réaction à -20 °C pendant 15-30 min. Tourner pendant 15 min à grande vitesse à 4 °C pour granuler l’ARN.REMARQUE: La pastille doit être visible contre la paroi du tube. Il est utile de noter comment le tube est aligné dans la centrifugeuse à cette étape, afin de prédire où la pastille devrait être à la fin du spin. Retirez soigneusement l’EtOH avec une seringue, en prenant soin d’éviter de chauffer, de trop sécher ou de déloger la pastille. Resuspendez la pastille dans 20 μL de H2O sans RNase. Vérifiez l’ARN pour vous assurer que la synthèse est réussie. Utilisez 1 μL pour dosage de la concentration sur un spectrophotomètre et exécutez 0,5 μL sur un gel d’agarose à 1 % pour vérifier la recherche d’une ou deux bandes discrètes, plutôt que d’un frottis de faible poids moléculaire. Le rendement de la réaction de transcription in vitro doit être d’environ 1 μg/μL. Aliquote et stockage de l’ARN à -20 °C ou -80 °C. L’ARN n’est dilué qu’immédiatement avant les injections. 2. Microinjection d’embryons de poisson-zèbre à 1 cellule REMARQUE: Injecter 200-300 pg par ARN pour obtenir une expression omniprésente de la chromatine et des membranes cellulaires tout au long de la morphogenèse de la coupe optique. Préparer 5 à 10 μL de dilution de l’ARN et charger 2,5 à 5 μL/aiguille; prévoyez un supplément au cas où l’aiguille se briserait. Préparations préalables pour les injections. Préparez une boîte de moulage par injection pour faciliter l’alignement et l’orientation des embryons à 1 cellule pour la micro-injection. Faire fondre 2% d’agarose dans E3 (milieu embryonnaire standard) et verser dans une boîte de Pétri. Faites flotter soigneusement le moule d’injection (voir Tableau des matériaux)sur le dessus de l’agarose chaude pour générer l’empreinte des creux dans l’agarose lorsqu’elle se solidifie. Une fois que l’agarose se solidifie, retirez le moule d’injection.REMARQUE: Les plats de moules d’injection peuvent être utilisés pendant plusieurs mois; couvrir dans E3 et conserver à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé. Tirez les aiguilles de micro-injection. Tirez les capillaires en verre vers une longue conicité pour fabriquer des aiguilles de micro-injection à l’aide d’une machine à tirer des aiguilles. Programmer la machine en fonction du type de capillaires utilisés. Pour les capillaires borosilicate de 1,0 x 0,78 mm, utilisez le programme suivant: chaleur = 546 °C, traction = 130, vitesse = 70, temps = 90(Figure 2F). Rangez les aiguilles dans une boîte de Pétri et fixez-les avec de la pâte à modeler.REMARQUE: La recette de traction varie en fonction de la machine et du filament, et les nouveaux filaments doivent toujours être étalonnés. Chaque tour de traction produit deux aiguilles(Figure 2G); faites-le plusieurs fois pour produire suffisamment d’aiguilles en cas de ruptures accidentelles et d’expériences futures. Diluer l’ARN coiffé pour l’injection. Diluer les ARN EGFP-CAAX et H2A-mCherry à une concentration de 200-300 ng/μL en utilisant H2Osans RNase et 1 μL de rouge phénol dans un volume total de 5 μL (la concentration finale de rouge phénol est de 0,1%). Faites glisser le mélange et tournez brièvement vers le bas pour recueillir le volume total. Conservez l’ARN dilué sur la glace avant l’injection. Injection d’embryons à 1 cellule Une fois que le poisson commence à se reproduire, prévoyez environ 15 à 20 minutes pour vous assurer que les œufs sont fécondés. Pendant ce temps, rechargez l’aiguille avec 2,5-5 μL de dilution de l’ARN à l’aide d’embouts de micro-chargeur P10 et P10. À l’aide d’un picoinjecteur, calibrer l’aiguille à l’aide d’un réticule oculaire (une lame d’étalonnage micrométrique suffit également) pour mesurer le volume de la gouttelette (volume d’une sphère = (4/3) * pi * rayon ^3). Réglez le temps et la pression d’injection de manière à ce que le volume d’injection soit de 1 nL(Figure 2I). À l’éventreur à rouleaux/pipette de transfert, charger soigneusement les œufs dans le moule d’injection(Figure 2J). Si cela est utile, utilisez des forceps pour rouler les embryons de manière à ce que la cellule unique soit visible, avant ou pendant l’injection. L’utilisateur préfère utiliser un micromanipulateur. Injecter des embryons au stade 1 cellule, en ciblant la cellule et non le jaune(Figure 2M). Cela garantira un étiquetage uniforme de l’embryon en développement. Élever les embryons au stade souhaité (avant 12 hpf, selon la stadification standard34). Les embryons injectés auront un développement retardé, alors élevez-les à une température légèrement plus élevée (29,0-29,5 ° C) pour rattraper le temps. Au cours de l’après-midi, vérifiez les embryons et retirez ceux qui sont morts pour préserver la santé de la couvée. 3. Montage d’embryons de poisson-zèbre au stade de vésicule optique pour l’imagerie timelapse Avant le montage, préparez 1,6 % d’agarose à faible teneur en fusion dans l’E3. Si vous planifiez plusieurs expériences d’imagerie, préparez environ 20 mL d’agarose à faible fusion et conservez-la à température ambiante. Le jour du montage de l’embryon, faites-le fondre pour générer une aliquote fraîche (1-5 mL) dans un tube qui peut être placé dans un bloc thermique de 42 °C avant le montage. Filtrer les embryons pour une injection réussie et la luminosité globale de la fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence avant le montage. Un échantillon idéal aura une forte fluorescence EGFP et mCherry et sera au bon stade de développement(Figure 3B – B”). Dépister les embryons à l’aide d’un microscope à fluorescence. Sélectionnez des embryons qui expriment fortement à la fois la fluorescence EGFP et mCherry pour le montage. Sélectionnez des embryons de 11 hpf. Compter les somites pour bien mettre en scène les embryons34; à 11 hpf il devrait y avoir 3 somites, et à 12 hpf il y a 6 somites.REMARQUE: En montant des embryons avant 12 hpf (à 11 hpf), les échantillons seront correctement mis en scène à 12 hpf lorsque le timelapse commencera. Déséchorionate des embryons avant le montage. Faites-le manuellement avec une pince fine ou chimiquement en utilisant de la pronase (2 mg / mL). Avec des embryons aussi jeunes, il est essentiel que la décchorionation soit effectuée dans un plat enrobé d’agar et que les embryons n’entrent pas en contact avec l’interface air-eau. À l’aide d’une pipette à rouleaux en verre, aspirez un embryon et éjectez autant d’E3 que possible de sorte que l’embryon se trouve à l’extrémité de la pipette Pasteur en verre. Déposer l’embryon dans le tube d’agarose du bloc thermique. Laissez-le s’enfoncer dans l’agarose pendant quelques secondes, puis aspirez d’abord de l’agarose, puis l’embryon, en vous assurant que l’embryon reste à l’extrémité de la pipette (Figure 3C – C’). Placez une antenne à fond de verre pour l’imagerie sous une lunette de dissection. Éjecter l’embryon et l’agarose dans une gouttelette d’agarose dans le plat à fond de verre. Utilisez des pinces pour vous orienter très rapidement, de sorte que l’embryon soit dorsal vers le bas (haut de la tête sur le fond en verre). Laisser durcir la gouttelette d’agarose (Figure 3D – D’). Cette étape doit être effectuée rapidement mais avec soin, car les embryons à ce stade sont fragiles. Les embryons endommagés ne survivront pas au processus d’imagerie timelapse.REMARQUE: Il est important d’orienter tous les embryons de manière cohérente pour cette expérience. Lors de l’exécution du timelapse, les embryons doivent s’adapter au champ de vision assigné tout en conservant un espace supplémentaire pour que la vésicule optique puisse se développer. Une orientation optimale consiste à aligner l’axe antérieur-postérieur de tous les embryons « verticalement » ou le long de 12 et 6 heures sur un cadran d’horloge(Figure 3G). Montez entre 10 et 12 embryons, soit plus du double de ceux qui seront imagés, afin que les meilleurs échantillons puissent être sélectionnés une fois évalués sur le confocal (Figure 3E – E’). Les échantillons seront évalués pour l’âge, l’uniformité de l’étiquetage fluorescent et la précision de l’orientation du montage. Après avoir monté les embryons, pipeter plus d’agarose pour couvrir complètement le fond du plat, enveloppant ainsi toutes les gouttelettes d’agarose séparées dans un seul grand disque d’agarose(Figure 3F – F’). Une quantité suffisante d’agarose garantira que les gouttelettes embryonnaires individuelles ou le disque entier ne se soulèvent pas du fond du plat et ne flottent pas hors de vue. Une fois durci, superposer l’agarose avec de l’E3 pour garder les échantillons hydratés pendant toute la durée de l’expérience d’imagerie timelapse (une préoccupation en fonction de l’humidité du bâtiment et de l’environnement).NOTE: La tricaïne n’est pas nécessaire pour ces expériences spécifiques d’imagerie timelapse, car ces embryons sont suffisamment jeunes; cependant, si vous le souhaitez, et si vous travaillez avec des embryons plus âgés, la tricaïne peut être ajoutée à l’agarose elle-même et superposée dans le milieu. Sur papier, dessinez une carte des embryons pour une référence facile lors de la mise en place d’un timelapse. Ceci est crucial pour associer ultérieurement la position au génotype de chaque échantillon. 4. Timelapse confocal à positions multiples avec un microscope confocal à balayage laser REMARQUE: Ce protocole d’imagerie timelapse a été conçu pour être utilisé avec un microscope confocal à balayage laser équipé d’un logiciel du fabricant (voir table des matériaux). Ce système est équipé d’un dispositif piézoélectrique z-stage qui permet une acquisition rapide des piles Z. Les lignes laser utilisées dans ce protocole sont un laser à ions Argon de 488 nm et un laser DPSS de 561 nm. Le laser 561 nm est bien adapté à l’imagerie du fluorophore mCherry : il est suffisamment proche du pic d’excitation mCherry (587 nm) et bien alimenté. Configurez le confocal. Mettez le confocal sous tension et connectez-vous à l’ordinateur de bureau. Installez l’insert piézo-Z-stage (Figure 4B), puis démarrez le logiciel d’acquisition. Dans le logiciel en mode Acquisition, allumez les lasers 488 et 561 à l’aide du menu déroulant (Figure 4F). Les lasers prennent plusieurs minutes à se réchauffer, donc cette étape est effectuée tôt pour gagner du temps.REMARQUE: Les paramètres d’acquisition sont les suivants: Cochez les cases Z-stack, Time Serieset Position. Définissez la taille d’image sur 512 (X) x 384 (Y), la vitesse de numérisation sur 9, le mode de numérisation sur bidirectionnel, le zoom sur 0,7, le sténopé sur 60,2 (1,63 unités aérées ~= section de 1,6 μm) et l’intervalle Z sur 2,1 μm. Cela donnera une taille d’image de 303,6 μm x 227,7 μm et une taille de pixel de 0,59 μm. Les lasers 488 et 561 doivent être vérifiés et affectés à la même voie; la plage de détection EGFP est de 494-545 nm et la plage de détection mCherry est de 598-679 (Figure 4F). Recouvrir généreusement le fond de la boîte en verre d’un milieu d’immersion correspondant à l’indice de réfraction de l’eau, en prenant soin d’éviter les bulles d’air (Figure 4C). Sélectionnez l’objectif d’eau 40x et appliquez une petite goutte de milieu d’immersion sur l’objectif(Figure 4D). Fixez le plat à fond de verre dans l’insert de scène, appliquez de l’E3 pour garder les embryons humides pendant la nuit, puis utilisez de la pâte à modeler pour sceller le couvercle en plastique sur le plat (Figure 4E). Élevez l’objectif d’entrer en contact avec le plat. Filtrez les échantillons et préparez-vous au timelapse. Passez de l’onglet Acquisition à l’onglet Localiser et cliquez sur le symbole de l’ampoule pour allumer la lumière transmise. Avec la lumière transmise, localisez le premier échantillon avec le joystick: à l’œil, déplacez d’abord l’échantillon dans le faisceau de lumière, puis utilisez les oculaires au centre et concentrez-vous sur une vésicule optique. Revenez à l’onglet Acquisition. Assurez-vous que les cases Z-stack, Time Serieset Positions sont cochées et que les lasers sont réchauffés pour être utilisés. Définissez la taille d’image sur 512 (X) x 384 (Y), la vitesse de numérisation sur 9, le mode de numérisation sur bidirectionnel et réglez Zoom sur 0,7. Sous la rubrique Canaux, commencez par affecter les lasers 488 et 561 à Power 2.0 et Gain 550 (cela peut être ajusté ultérieurement). Réglez le sténopé sur 60,2 (1,63 unités aérées ~= section de 1,6 μm). Commencez l’analyse à l’aide du bouton Continu. Avec le bouton de mise au point fine, localisez l’échantillon dans l’axe Z et positionnez l’axe X-Y dans le cadre. Arrêtez l’analyse. Sous l’en-tête Positions, cliquez sur Ajouter pour enregistrer les informations XYZ sur le premier échantillon (Figure 4F). Faites-le uniquement pour que les échantillons soient chronométrés. Sélectionnez les échantillons pour leur forte fluorescence et leur montage optimal. Basculez vers l’onglet Localiser, passez à l’exemple suivant et répétez les étapes 4.2.5 à 4.2.6, en étant sélectif dans le choix des échantillons. Finalisez les positions des échantillons, attribuez la plage z, puis démarrez le timelapse. Une fois que tous les échantillons sont sélectionnés (il est possible d’imager 4 à 5 échantillons dans l’intervalle de temps total de 2,5 minutes) et que les positions sont enregistrées, parcourez chaque échantillon et ajustez la position XYZ dans le cadre de visualisation. Mettez en surbrillance la première position et cliquez sur Déplacer vers. Tout en scannant en continu, alignez la vésicule optique dans le cadre. Laissez suffisamment d’espace dans les régions antérieures et distales par rapport à la vésicule optique et au cerveau. Ensuite, affectez la première et la dernière tranche Z en sélectionnant Définir en premier et Définir en dernier tout en vous déplaçant dans la direction Z avec le bouton de mise au point fin. Maintenez un nombre total de tranches d’environ 63, car cela permettra la croissance de la tasse optique. Prévoir de l’espace supplémentaire sur la face ventrale de la vésicule optique pour permettre la croissance. Une fois que la première et la dernière tranche Z ont été définies, cliquez sur le bouton C pour vous déplacer vers le centre de la pile Z. Ajuster la puissance et le gain du laser pour les deux lasers; si possible, maintenez la puissance du laser en dessous de 5 et utilisez un gain plus élevé, si nécessaire. Arrêtez l’analyse. Mettez à jour les informations de position en cliquant sur Mettre à jour. Passez à la position suivante en cliquant sur Position 2. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.3 pour chaque position attribuée. La puissance et le gain du laser doivent être réglés de manière à ce que tous les échantillons soient suffisamment éclairés. Une fois les informations de position et les paramètres laser finalisés, attribuez des paramètres de série chronologique. Sous l’en-tête Série chronologique, affectez Intervalle de temps à 2,5 min et Cycles à 300(Figure 4F). Le nombre de cycles est calculé de telle sorte que le timelapse passe au-delà de l’étape de 24 hpf, lorsque le développement de la coupe optique est terminé. Pour commencer le timelapse, cliquez sur Démarrer. Surveillez le premier cycle complet : utilisez une minuterie pour vous assurer qu’un cycle complet (imagerie de toutes les positions) est inférieur à 2,5 minutes et vérifiez que chaque position semble correcte. Le microscope fonctionne indépendamment pendant la nuit et n’a pas besoin d’être surveillé.REMARQUE: Bien que la température de la pièce confocale soit contrôlée, la température ambiante est de 20 à 25 ° C. Avec l’équipement en marche et le balayage laser, la température sur la scène semble être plus proche de 28,5 ° C, puisque le développement embryonnaire se déroule à ce rythme attendu, tel que dosé visuellement avec des repères morphologiques. Avec ces réglages, le timelapse durera 12,5 h. Enregistrez le fichier une fois le timelapse terminé. Il sera grand (~ 40 Go) et peut être séparé en positions individuelles après avoir été enregistré à l’aide du logiciel d’acquisition.