A المقايسة المستندة إلى لوحة لقياس إطلاق مونوامين الذاتية في شرائح الدماغ الحادة

ويرتبط عدد كبير من الأمراض العصبية والنفسية مع dysregulation أو الصيانة غير كافية من الناقل العصبي مونوامين (الدوبامين [DA], السيروتونين [5-HT], النورادرينالين [NE]) homeostasis1,2,3. وتشمل هذه الشروط، على سبيل المثال لا الحصر، ^{الاكتئاب1،2}، ^{الفصام2}، ^القلق2، ^{الإدمان4}، انقطاع الطمث5^،6،7، ^pain8، ومرض ^{باركنسون3}. على سبيل المثال، أظهرت العديد من نماذج الفئران من انقطاع الطمث أن خلل التنظيم أو الحد من مونوامين داخل قرن آمون، قشرة الجبهي، والمزمع قد تكون مرتبطة مع كل من الاكتئاب والتدهور المعرفي، والذي ينظر إليه في النساء اللواتي يعانين من انقطاع الطمث. وقد تم فحص خلل تنظيم مونوامين في هذه النماذج على نطاق واسع باستخدام HPLC-ECD, على الرغم من أن الدراسات لم تميز بين محتوى الناقل العصبي المقاس مقابل الافراج عن الناقل العصبي ^5,6,7. يتم إطلاق مونوامينات كلاسيكيا في الفضاء خارج الخلية من خلال ^{Ca2 +} تعتمد على الافراج عن ^{المركبات9}، ويتم إعادة تدويرها مرة أخرى من خلال نظام إعادة امتصاص غشاء البلازما الخاصة بهم (ناقل الدوبامين، DAT؛ الناقل السيروتونين، SERT؛ ناقل النورادرينالين، NET)^10،11. وعلى العكس من ذلك، تشير البيانات إلى أن هؤلاء الناقلين قادرون على إطلاق أو إطلاق مونوامينات الإيفلاكس، حيث أن المخدرات التي تتعاطى مثل الأمفيتامين (AMPH) و 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA) معروفة بإطلاق DA و 5-HT، على التوالي من خلال أنظمة النقل الخاصة بهم12,13,14,15,16,17 . وبالتالي ، فإن الفهم الآلي السليم لديناميكيات إطلاق أحادي الأمين أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات دوائية محددة ومستهدفة.

وقد استخدمت مجموعة واسعة من التقنيات لدراسة إطلاق أحادي الأمين مثل المسح السريع Cyclic Voltammetry (FSCV)¹⁸، في التحليل الدقيق في الجسم ^الحي13، ^{والتصوير19}، والتنبيب المسبق مع مونوامينات ²⁰ ذات السمية الإشعاعية، وعلم البصريات، ومؤخرا، أجهزة الاستشعار الفلورية المشفرة وراثيا وقياس الفوتومتر21^،22 . FSCV وفي الغسيل المجهري في الجسم الحي هي التقنيات الأولية المستخدمة لدراسة إطلاق مونوامين. يستخدم FSCV لدراسة إطلاق الإكسيتوتيك المحفز ، في المقام الأول ، DA في شرائح الدماغ الحادة وفي ^vivo23. لأن FSCV يستخدم الأقطاب الكهربائية لتحفيز أو استحضار الإفراج, المصدر الرئيسي لإطلاق الناقل العصبي هو ^{Ca2 +}تعتمد على الافراج عن المركبات18,24,25,26,27,28,29,30,31 . في التحليل الدقيق في الجسم الحي إلى جانب تدابير HPLC التغيرات في مستويات الناقل العصبي خارج الخلية باستخدام مسبار وضعت في منطقة الدماغ من ^{الفائدة13,32}. على غرار FSCV ، هناك قيد كبير على غسيل الكلى الدقيق في الجسم الحي هو صعوبة تحديد مصدر إطلاق الناقل العصبي: إطلاق المركبات المعتمدة ^{Ca2 +} أو الناقل التابع. والجدير بالذكر أن كلا الأسلوبين يسمحان بالقياس المباشر لإطلاق أحادي الأمين. من خلال التقدم الأخير في علم الوراثة البصرية ، تظهر الأبحاث الكشف عن إصدار 5-HT و DA في فترة زمنية قصيرة مع خصوصية رائعة من نوع ^{الخلية21،22}. ومع ذلك، تتطلب هذه الاستراتيجيات تقنيات ومعدات معقدة ومكلفة، وتقيس بشكل غير مباشر إطلاق مونوامين، وتحديدا من خلال ربط أحادي الأمين بالمستقبلات. وعلاوة على ذلك، تستخدم مونوامينات ذات علامات إشعاعية أيضا لدراسة ديناميات مونوامين. قد يتم تحميلها مسبقا مونوامينات ذات العلامات المشعة في مختلف النظم النموذجية مثل خلايا heterologous الإفراط في التعبير عن كل ناقل مونوامين20,33,34,35,36,37,38,39,40, الخلايا العصبية ^{الأولية20}, synaptosomes3,39,41^{, 42}، وشرائح الدماغ ^{الحادة43,44}. ومع ذلك ، فإن النشاط الإشعاعي يشكل ضررا محتملا للمجرب ، وقد لا يقوم التحليل المسمى بالتريتيوم بتلخيص ديناميكيات مونوامين الذاتية ^4545.46 بأمانة. وقد سمحت أنظمة التخسين الفائقة جنبا إلى جنب مع أساليب الكشف خارج الخط مثل HPLC-ECD للكشف عن مونوامينات من مصادر أنسجة متعددة. هنا، يوفر هذا البروتوكول كطريقة محسنة ومنخفضة التكلفة وبسيطة ودقيقة باستخدام شرائح الدماغ الحادة لقياس مباشرة القاعدية الذاتية وتحفيز إطلاق مونوامين.

شرائح الدماغ الحادة تسمح لاختبار الفرضيات الميكانيكية، في المقام الأول لأنها تحافظ على البيئة الدقيقة التشريحية في الجسم الحي، والحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي ^{سليمة47،48،49،50،51،52}. في عدد قليل من الدراسات، تم استخدام شرائح الدماغ الحادة أو أنسجة الدماغ المفرومة بالتزامن مع تقنية التغميس الفائق باستخدام KCl لتحفيز إطلاق ^Ca2+ بوساطة53,54,55,56. وكانت أنظمة التخسين الفائق حاسمة لتعزيز فهم الميدان لآليات إطلاق الناقل العصبي، بما في ذلك مونوامينات. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة مكلفة نسبيا ، ويتراوح عدد الغرف المتاحة لتحليل الأنسجة من 4 إلى 12. وبالمقارنة، فإن الطريقة المعروضة هنا غير مكلفة، وتسمح بقياس 48 عينة من الأنسجة، ويمكن صقلها لاستخدام ما يصل إلى 96 عينة من الأنسجة. يحتوي كل بئر داخل اللوحة ذات ال 48 بئرا على حاملات أنسجة تستخدم مرشحات لفصل المنتج الصادر عن الأنسجة ، ثم يتم جمع مونوامينات تم إطلاقها وتحليلها من قبل HPLC-ECD. الأهم من ذلك، تسمح هذه الطريقة للقياس المتزامن لإطلاق سراح 5-HT، DA، وNE من مناطق الدماغ المختلفة مثل قشرة الجبهي، والحصين، والمزمع الظهري بعد العلاج مع العوامل الدوائية التي تعدل إطلاق مونوامين. وهكذا، يمكن للمجرب الإجابة على أسئلة متعددة باستخدام نظام متعدد الآبار غير مكلفة أن يزيد من عدد العينات التي تم اختبارها، وبالتالي تقليل عدد الحيوانات المستخدمة.