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유전학

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Published: December 11, 2020
doi:
10.3791/62001
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,The University of Tulsa

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l’editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

Abstract

Il sistema batterico Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) è stato sfruttato dai ricercatori per studiare importanti problemi biologicamente rilevanti. La potenza senza precedenti del metodo di modifica del genoma CRISPR / Cas consente ai ricercatori di modificare con precisione qualsiasi luogo di loro scelta, facilitando così una maggiore comprensione della funzione genica. Diversi metodi per la modifica del genoma di C. elegans da CRISPR / Cas9 sono stati descritti in precedenza. Qui, discutiamo e dimostriamo un metodo che utilizza complessi di ribonucleoproteine assemblati in vitro e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. In particolare, in questo articolo, passiamo attraverso il processo passo-passo di introduzione di codoni di arresto prematuri nel gene C. elegans rbm-3.2 mediante riparazione diretta all’omologia utilizzando questo metodo di editing CRISPR / Cas9. Questo metodo di editing relativamente semplice può essere utilizzato per studiare la funzione di qualsiasi gene di interesse e consente la generazione di C. elegans modificati omozigoti mediante l’editing CRISPR / Cas9 in meno di due settimane.

Introduction

La tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) consente un efficiente editing mirato del genoma in una vasta gamma di organismi1,2,3,4. Il sistema CRISPR è stato scoperto per la prima volta come parte di una risposta immunitaria antivirale procariotica5,6,7. Il sistema CRISPR di tipo II utilizza un’endonucleasi come Cas9, un RNA transattivante (tracrRNA) e un breve RNA CRISPR a guida lunga a 20 nucleotidi bersaglio specifico per il DNA (crRNA) per riconoscere un “NGG” Protospacer Adjacent Motif (PAM) e fare una rottura a doppio filamento nel DNA bersaglio5,6,7,8,9,10,11,12. Questa rottura a doppio filamento è riconosciuta come una lesione dal meccanismo di riparazione del DNA cellulare. Di conseguenza, la rottura generata a doppio filamento può essere riparata da uno dei due percorsi: i) Unione di estremità non omologa (NHEJ) o ii) Riparazione diretta dall’omologia (HDR)13. NHEJ è spesso soggetto a errori e quindi, quando questo percorso viene utilizzato per riparare la rottura a doppio filamento nel DNA bersaglio, spesso causa mutazioni inattivanti (inserzioni, delezioni) nel gene di interesse. D’altra parte, fornendo un modello di riparazione esogena con omologia su entrambi i lati della rottura a doppio filamento, il meccanismo di riparazione del DNA cellulare può essere indirizzato a utilizzare HDR per riparare la rottura13. Il metodo HDR consente quindi l’editing preciso di qualsiasi luogo di interesse.

Una varietà di protocolli di editing genetico CRISPR/Cas9 sono stati descritti per C. elegans14,15,16,17,18,19,20. I metodi di editing CRISPR / Cas9 più comunemente impiegati in C. elegans includono sia protocolli basati sulla clonazione che senza clonazione per generare modelli di riparazione per l’editing CRISPR / Cas914,15,16,17,18,19,20. Questo protocollo discute in dettaglio un protocollo di editing CRISPR/Cas9 privo di clonazione basato sull’utilizzo di dpy-10 come marcatore co-CRISPR per lo screening. Fino ad ora, l’unico protocollo video di editing CRISPR / Cas9 dettagliato focalizzato su C. elegansesistente utilizza un marcatore fluorescente per lo screening21. Tuttavia, l’utilizzo di un marcatore fluorescente per lo screening richiede l’accesso a un microscopio a fluorescenza, a cui molti laboratori di piccole istituzioni principalmente universitarie (PUI) possono trovare difficile accedere. È incoraggiante notare che risultati correlativi positivi sono stati ottenuti in studi precedenti tra vermi portatori di marcatori fluorescenti e la presenza dell’edit21,22. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per determinare l’efficienza complessiva del metodo di screening basato sulla fluorescenza per la modifica di un’ampia varietà di loci con diversi RNA guida e modelli di riparazione. Infine, poiché i plasmidi che codificano per questi marcatori fluorescenti formano matrici extracromosomiali, la fluorescenza variabile viene spesso prodotta da questi array che possono rendere difficili da identificare i positivi23. Quindi, sebbene il metodo di screening basato sulla fluorescenza possa essere utile da adottare, le questioni sopra menzionate possono limitarne l’applicabilità.

L’uso di un marcatore co-CRISPR che produce un fenotipo visibile riduce notevolmente il numero di progenie che devono essere sottoposte a screening per trovare un verme modificato positivamente23,24,25,26,27,28. È importante sottolineare che i fenotipi prodotti da questi marcatori possono essere facilmente rilevati sotto un semplice microscopio di dissezione23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Il marcatore dpy-10 co-CRISPR è uno dei marcatori co-CRISPR meglio caratterizzati e ampiamente utilizzati per l’esecuzione dell’editing del genoma C. elegans CRISPR/Cas924,27. Pertanto, questo articolo discuterà il metodo di esecuzione dell’editing CRISPR / Cas9 in C. elegans utilizzando la consegna diretta di complessi di ribonucleoproteine con dpy-10 come marcatore co-CRISPR27,35. In questo metodo, il mix di iniezione di editing preparato è costituito da un modello di riparazione dpy-10 crRNA e dpy-10 ben caratterizzato per mediare la generazione di un fenotipo “rullo” dominante osservabile (Rol) che viene conferito da una nota mutazione eterozigote dpy-10 (cn64) all’interno del gene dpy-10 24,27,29. Quando presente nel suo stato omozigote, la mutazione dpy-10(cn64) provoca un fenotipo dumpy (Dpy) che produce vermi più corti e robusti24,29. Il fenotipo Rol è mediato dall’inserimento accurato del modello di riparazione dpy-10 co-fornito in una singola copia del gene dpy-10 mediante editing CRISPR/Cas9 mediato da HDR. Pertanto, l’aspetto di Rol C. elegans indica un’iniezione di successo e un evento di editing mediato dall’HDR di successo all’interno delle cellule del verme iniettato. Poiché il crRNA e il modello di riparazione del gene bersaglio di interesse sono nella stessa miscela di iniezione con il modello di riparazione dpy-10 crRNA e dpy-10, c’è una buona probabilità che anche i vermi Rol identificati siano stati modificati contemporaneamente al gene bersaglio di interesse. Quindi, questi worm Rol vengono quindi sottoposti a screening per la modifica di interesse con tecniche come la reazione a catena della polimerasi (PCR) (per modifiche superiori a 50 bp) o mediante PCR seguita da digestione di restrizione (per modifiche inferiori a 50 bp).

I vantaggi dell’utilizzo di questo metodo per l’editing del genoma sono: i) le modifiche CRISPR possono essere generate con un’efficienza relativamente elevata (dal 2% al 70%) utilizzando questo metodo27; ii) i modelli di riparazione e gli RNA guida utilizzati in questo metodo non comportano la clonazione, riducendo così il tempo necessario per la loro generazione; iii) assemblando complessi di ribonucleoproteine in vitro,le concentrazioni dei complessi di editing assemblati possono essere mantenute relativamente costanti, migliorando così la riproducibilità; iv) alcuni RNA guida che non riescono a generare modifiche quando espressi da plasmidi hanno dimostrato di funzionare per l’editing del genoma CRISPR / Cas9 quando forniti come crRNA trascritti in vitro 27; v) l’inclusione del marcatore dpy-10 co-CRISPR consente un facile screening utilizzando un microscopio di dissezione e diminuisce il numero di progenie che devono essere sottoposte a screening per trovare positivi24,27; e vi) Il sequenziamento del DNA verificato linee di vermi modificati omozigoti può essere ottenuto con questo metodo entro un paio di settimane19,27.

Eccellenti capitoli di libri relativi a molti diversi metodi CRISPR di C. elegans sono stati pubblicati14,15,16,17,18,19,20,43. Tuttavia, la dimostrazione del metodo dpy-10 co-CRISPR in un formato video in un ambiente di laboratorio è attualmente carente. In questo articolo, descriviamo e dimostriamo il processo di utilizzo del metodo dpy-10 co-CRISPR per modificare un gene bersaglio rappresentativo chiamato rbm-3.2, una proteina putativa legante l’RNA (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  In particolare, qui descriviamo in dettaglio il metodo di introduzione di tre codoni di arresto prematuro all’interno del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati in vitro e un modello di riparazione lineare a singolo filamento fornito esogenamente. Questi studi hanno avuto successo nel generare il primo ceppo CRISPR di C. elegans con codoni di arresto prematuri nel gene rbm-3.2. Poiché attualmente non si sa molto sulla funzione di questo gene in C. elegans, questo ceppo servirà come strumento utile per sezionare la funzione di RMB-3.2. Questo metodo può anche essere adottato per effettuare inserzioni, sostituzioni e delezioni in qualsiasi luogo all’interno del genoma di C. elegans.

Protocol

Questo protocollo per l’editing del genoma CRISPR / Cas9 è stato approvato dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell’Università di Tulsa seguendo le linee guida NIH. Durante tutto questo protocollo, è stata praticata la tecnica sterile. Tutte le fasi di questo protocollo sono state eseguite utilizzando reagenti privi di nucleasi. Particolare attenzione è stata prestata per prevenire la contaminazione da RNasi come guanti per la pulizia, spazi di lavoro e attrezzature (ad esempio pipette, esterni di oggetti in vetro, ecc.) con una soluzione decontaminante RNase. 1. disegno crRNA Trova il PAM che consente a Cas9 di tagliare più vicino al sito di modifica. Il sito PAM è 5′-NGG-3′. Ricorda che il PAM può trovarsi su entrambi i filamenti del DNA. Selezionare 20 bp all’estremità 5′ del PAM come sequenza crRNA.NOTA: la sequenza di crRNA effettiva che viene sintetizzata dalle società commerciali è più lunga di 20 bp in quanto ha una sequenza generica aggiuntiva che viene automaticamente aggiunta alla sequenza di crRNA 20 bp specifica del target dalla società di sintesi. Per quanto riguarda gli effetti off-target, studi recenti non hanno trovato effetti off-target di Cas9 in C. elegans36,37,38,39,40. Inoltre, i ceppi risultanti con CRISPR-edited vengono superati. Pertanto, non siamo molto preoccupati per gli effetti fuori bersaglio dei crRNA progettati. Tuttavia, i siti Web online tra cui http://genome.sfu.ca/crispr/ e http://crispor.tefor.net/ possono essere utilizzati per trovare e selezionare i crRNA con gli effetti meno fuori bersaglio38,41. Si prevede che i crRNA che terminano con un G o GG e quelli con un contenuto gc superiore al 50% siano più efficienti19,23,42. Ordinare almeno 10 nmol di crRNA da un’azienda (ad esempio IDT, Horizon Discovery, ecc.). Una volta arrivato il crRNA liofilizzato, conservarlo a -30°C fino al giorno della microiniezione. Il giorno dell’esecuzione della microiniezione, ruotare il crRNA liofilizzato alla massima velocità (17.000 x g) per un minuto e ricandidarlo in 5 mM Tris-Cl (pH 7,4) per creare uno stock di 8 μg / μL del crRNA. Conservare il brodo di crRNA non utilizzato congelato a -80 °C. 2. Ripara il design del modello Scarica un software di manipolazione delle sequenze (ad es. Visualizzatore di sequenze CLC, APE, Snapgene, Vector NTI, ecc.). Usiamo CLC sequence viewer versione 8.0 (Qiagen) in quanto è facile da usare e può essere scaricato gratuitamente. Incollare la sequenza del DNA di destinazione di interesse nel visualizzatore di sequenze. L’orientamento del modello di riparazione influenza l’efficienza di modifica28. Per inserire una sequenza di riparazione all’estremità 5′ del PAM, progettare un modello di riparazione a singolo filamento con sequenza di DNA dallo stesso filamento di DNA su cui si trova la sequenza PAM (filamento protospacer)28. Mentre per l’inserimento di una sequenza di riparazione all’estremità 3′ del PAM, progettare un modello di riparazione a singolo filamento con sequenza di DNA dal filamento di DNA che non trasporta la sequenza PAM (filamento distanziatore)28. Selezionate 35 coppie di basi di sequenza con omologia ininterrotta su entrambi i lati (all’estremità 5′ e 3′) del montaggio. Muta o elimina il PAM per evitare il taglio del modello di riparazione o del DNA genomico modificato da Cas9. Se la mutazione del PAM non è possibile, introdurre diverse mutazioni silenziose vicino all’estremità 5′ del PAM per evitare il taglio del modello di riparazione o del DNA genomico modificato. Assicurarsi di introdurre mutazioni silenziose del PAM solo se è presente in una regione esonica. Controllare la frequenza di utilizzo del codone per assicurarsi che il codone mutato sia introdotto a una frequenza paragonabile al codone originale non mutato (ad esempio https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). In alcuni casi, potrebbe non essere possibile introdurre il codone mutato con una frequenza simile al codone non mutato. Tuttavia, per fare mutazioni di alcuni amminoacidi, non ci aspettiamo che il livello di espressione della proteina mutante venga alterato in modo significativo. Se la modifica è piccola (ad esempio mutazione di alcune basi), introdurre un sito di restrizione univoco vicino alla modifica mediante mutagenesi silenziosa. Usiamo http://heimanlab.com/cut2.html per trovare siti di restrizione che possono essere introdotti dalla mutagenesi silenziosa. Controllare la frequenza di utilizzo del codone per assicurarsi che il codone mutato sia introdotto a una frequenza paragonabile al codone originale non mutato. Come detto sopra, questo non è sempre possibile. Tuttavia, per gli esperimenti che coinvolgono mutazioni di alcuni amminoacidi, non ci aspettiamo che il livello di espressione della proteina mutante venga alterato in modo significativo. Sintetizzare e acquistare modelli di riparazione lineari a singolo filamento per HDR come oligo ultramer 4 nmol. Risuspenare il modello di riparazione degli oligonucleotidi liofilizzati in acqua priva di nucleasi per creare uno stock di 1 μg / μL del modello di riparazione e conservarlo a -30 ° C fino a un ulteriore utilizzo. 3. Progettazione del primer di screening Utilizzando il visualizzatore di sequenze CLC o altre applicazioni simili, progettare da 20 a 23 coppie di basi rispettivamente in avanti e inversa su entrambi i lati dell’editing, in modo tale da produrre una banda compresa tra 400 e 600 coppie di basi sull’amplificazione PCR. Per inserimenti più grandi di dimensioni diverse, progettare il primer in avanti in modo che si trovi appena fuori dal braccio omologico sinistro del modello di riparazione. Progettare il primer inverso in modo che si trovi all’interno del modello di riparazione stesso. In questo caso, un prodotto PCR sarà ottenuto solo nel caso di worm modificati positivamente. Per identificare i worm modificati omozigoti per inserimenti più lunghi, amplificare l’intera regione dell’inserzione progettando primer avanti e indietro che si trovano all’esterno delle giunzioni di inserimento. Testare i primer e ottimizzare le condizioni di PCR con DNA genomico wild-type prima di utilizzare i primer per la genotipizzazione. Assicurarsi che una singola banda di dimensioni previste sia prodotta dopo l’amplificazione PCR del DNA genomico (ove applicabile). 4. Preparazione di giovani vermi adulti per l’iniezione Raccogliere L2-L3 stadio C. elegans su un prato batterico fresco su una piastra MYOB e incubare a 20 °C durante la notte.NOTA: Il protocollo per la realizzazione di piastre MYOB può essere trovato qui: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/ Il giorno della microiniezione, scegli giovani vermi adulti con meno di 10 embrioni nell’utero da iniettare. 5. Preparazione della miscela di iniezione Preparare la miscela per iniezione nello stesso ordine indicato nella Tabella 1 in tubi sterili privi di nucleasi.NOTA: i componenti della miscela di iniezione possono essere ridimensionati per produrre miscele di iniezione da 5 μL (invece di 20 μL) se non sono previste iniezioni future con questa miscela. Mescolare la miscela di iniezione mediante pipettaggio. Incubare la miscela per iniezione a 37 °C per 15 minuti per assemblare complessi di ribonucleoproteine. Ruotare la miscela di iniezione a 4 °C a 17.000 x g per 5 minuti. 6. Microiniezione nella gonna C. elegans Eseguire la microiniezione della miscela di iniezione CRISPR nella gonna C. elegans, come descritto in Iyer et al. 201943. Iniettare circa 30 vermi con la miscela di iniezione CRISPR. La miscela di iniezione non utilizzata può essere riutilizzata conservando a 4°C per un periodo di circa 6 mesi senza perdita di efficienza49. Iniettare entrambe le braccia delle gonne, se possibile. I vermi iniettati sono considerati la generazione P0. 7. Recupero e trasferimento di worm iniettati Dopo la microiniezione, spostare i vermi P0 microiniettati utilizzando un worm-pick su una piastra di agar MYOB da 60 mm seminata con OP50 E. coli e lasciarli recuperare a temperatura ambiente per circa un’ora. Si noti che la temperatura di recupero dipenderà dal genotipo dei vermi iniettati. Ad esempio, per i ceppi sensibili alla temperatura, potrebbe essere necessario il recupero dei vermi a una temperatura diversa. Utilizzando un plettro a vite senza fine a filo di platino, trasferire ogni verme iniettato su una singola piastra di petri agar MYOB da 35 mm con semi e consentire loro di deportare le uova a 20 ° C fino al giornosuccessivo. Si noti che alcuni vermi moriranno a causa di lesioni dalla procedura di microiniezione. Scegli solo quei vermi che sono vivi e mostrano movimento. Dopo 24 ore, trasferire i vermi iniettati su nuove piastre individuali (1 verme per piastra). 8. Raccolta C. elegans per lo screening Da 3 a 4 giorni a 20°C dopo l’iniezione, monitorare tutte le piastre che contengono la progenie dei vermi iniettati utilizzando un microscopio sezionante. Identificare le piastre che hanno fenotipi F1 progenie che esibiscono rulli (Rol) e dumpy (Dpy). Un fenotipo Dpy è dove i vermi appaiono più corti e più robusti dei vermi di controllo nella stessa fase di sviluppo (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10). Le placche con vermi Rol e Dpy rappresentano placche in cui la progenie F1 è stata modificata con successo con la mutazione dpy-10 (cn64) per essere presente nel suo stato eterozigote o omozigote, rispettivamente. Scegli le piastre con il maggior numero di vermi a rulli e dumpy per lo screening. Individua da 50 a 100 vermi F1 Rol da queste piastre alle loro piastre individuali (1 verme per piastra) e consenti loro di depostare le uova. Lasciare che i vermi F1 Rol A stadi L4 desovano le uova e producano progenie (F2) per 1 o 2 giorni. 9. Lisi a singolo verme e PCR Dopo aver prodotto F2 per 1 o 2 giorni, trasferire ogni madre F1 Rol in 2,5 μL di tampone di lisi (Tabella 2) con una diluizione 1:100 di 20 mg/mL di Proteinasi K. Congelare i tubi a -30 °C per 20 minuti. I vermi possono essere conservati in questa fase per un periodo prolungato fino a ulteriori analisi. Eseguire la lisi a vite senza fine singola su un termociclatore PCR con le seguenti condizioni: 60 °C per 1 ora, 95 °C per 15 minuti e tenere a 4 °C. Aggiungere i seguenti reagenti direttamente a 2,5 μL del tubo PCR contenente verme liscio: 12,5 μL di miscela PCR 2x contenente dNTPs, DNA polimerasi, MgCl2 e colorante di carico, 1 μL di primer avanzato da 10 μM, 1 μL di primer inverso da 10 μM e acqua sterile a 22,5 μL. Il volume totale di ogni reazione PCR è di 25 μL.NOTA: In caso di screening di più worm F1, è più veloce e più conveniente creare un master-mix PCR per reazioni multiple e aggiungere 22,5 μL del master-mix a ciascun tubo di lisi. Impostare le reazioni PCR su un termociclatore con le seguenti condizioni: 95 °C per 1 minuto, 35 cicli di 95 °C per 15 s, 55 °C per 15 s (ottimizzare per ogni set di primer), 72 °C per 1 minuto (ottimizzare per ogni DNA target)44. Tenere le reazioni a 4 °C. 10. Restrizione della digestione ed elettroforesi su gel di acarosio NOTA: una digestione di restrizione è necessaria solo durante lo screening per piccole modifiche (meno di 50 bp). Trasferire 10 μL del DNA PCR dalla fase 9 a un nuovo tubo. Aggiungere da 2 a 4 unità di enzima di restrizione e 1x tampone enzimatico di restrizione (1,5 μL di tampone di reazione 10x) per 15 μL di reazione. Incubare a 37 °C (o ad altra temperatura enzimatica specifica) per 2 ore (tempi di incubazione più brevi possono essere possibili con enzimi ad azione rapida). Il calore inattiva il digest di restrizione riscaldando i tubi PCR a 65 °C (o altra temperatura specifica dell’enzima) per 10-15 minuti. Caricare l’intera reazione da ciascun tubo PCR in un singolo pozzetto di un gel di acarosio all’1% -2% e far funzionare il gel a 110 mA fino a ottenere una corretta separazione della banda.NOTA: Utilizziamo un mix PCR che ha già un colorante di carico incluso per la visualizzazione durante l’esecuzione su un gel di agarose. Questo mix non interferisce con la reazione di digestione di restrizione ed è quindi comodo da usare per lo screening di molti vermi contemporaneamente. 11. Identifica i worm modificati positivamente Visualizza i gel di agarose sotto la luce UV (per i gel di bromuro di etidio) per rilevare le dimensioni della banda del DNA.NOTA: i vermi modificati positivamente mostreranno una banda extra di DNA alle dimensioni previste a causa della modifica utilizzando il modello di riparazione che trasporta il sito di restrizione nel locus desiderato all’interno del genoma del verme. I worm a rulli F1 dovrebbero essere eterozigoti per la modifica e quindi dovrebbero presentare tre bande (un prodotto PCR non tagliato wild-type e due frammenti più piccoli dal prodotto PCR tagliato modificato). Sebbene raro, va notato che gli omozigoti sorgono occasionalmente. Salvare tutte le lastre originali modificate positivamente fino a quando la presenza della modifica non viene verificata dal sequenziamento Sanger. 12. Modifica omozigote di interesse Scegli tra 8 e 12 vermi F2 dall’aspetto selvaggio non rotolanti dalle rispettive piastre di vermi F1 Rol modificate positivamente e consenti loro di depostare le uova e produrre progenie per 1 o 2 giorni.NOTA: Poiché C. elegans sono ermafroditi autofecondanti, se l’allele modificato non influisce sulla vitalità o sullo sviluppo, la percentuale di mutanti omozigoti attesi dovrebbe essere di circa il 25%. I vermi F2 non rotolanti devono essere wild-type per il locus dpy-10. La scelta di vermi non rotolanti consente la generazione di vermi modificati che hanno perso la mutazione dpy-10 (cn64) e hanno solo la mutazione nel gene di interesse. Si noti che il gene dpy-10 è presente sul cromosoma II. Se il tuo gene di interesse è collegato a dpy-10,potresti non essere in grado di separare facilmente la mutazione dpy-10 dal tuo gene di interesse. Eseguire i passaggi da 9 a 11 per identificare le linee di worm omozigoti. 13. Conferma la modifica sequenziando Una volta identificati i vermi omozigoti, eseguire la lisi e la PCR come descritto nel passaggio 9. Impostare almeno 3 reazioni PCR per ogni linea omozigote da sequenziare. Purificare le reazioni PCR utilizzando un kit di purificazione PCR. Misura la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro a goccia nano. Inviare il campione con il rispettivo primer in avanti per il sequenziamento Sanger. Assicurarsi che il primer in avanti sia progettato per trovarsi ad almeno 50 basi di distanza dalla modifica da sequenziare. Analizza i risultati della sequenza utilizzando un software di analisi della sequenza per confermare la presenza della modifica.

Representative Results

rbm-3.2 è una presunta proteina legante l’RNA che ha omologia alla variante tau del fattore di stimolazione della scissione umana (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). La proteina RBM-3.2 è stata identificata come partner legante della proteina fosfatasi 1 (GSP-1) e dei suoi regolatori Inibitore-2 (I-2SZY-2) e SDS-22 in uno studio precedente che ha identificato queste proteine come nuovi regolatori della duplicazione del centriolo C. elegans (dati non mostrati)45. Attualmente, si sa molto poco riguardo alla funzione del gene rbm-3.2 in C. elegans. Quindi, per indagare ulteriormente il ruolo biologico del gene C. elegans rbm-3.2, l’allele rbm-3.2-null rbm-3.2(ok688) è stato ottenuto dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC). Sfortunatamente, oltre a possedere una delezione dell’intero gene rbm-3.2, l’allele rbm-3.2 (ok688) provoca anche una delezione parziale di un gene sovrapposto, rbm-3.1, complicando così l’analisi genetica. Pertanto, al fine di studiare con precisione il ruolo del gene rbm-3.2 in C. elegans, abbiamo usato l’editing CRISPR / Cas9 per introdurre tre codoni di arresto prematuro molto vicini all’inizio della regione codificante C. elegans rbm-3.2, lasciando intatto il gene rbm-3.1 sovrapposto. Per introdurre questi codoni di arresto prematuri nel gene C. elegans rbm-3.2, abbiamo progettato un crRNA con un motivo PAM che si trovava sul filamento opposto (filamento modello) di DNA ( Figura1A). Il sito di taglio Cas9 si trovava a 6 basi di distanza dal codone di avvio rbm-3.2 ATG. Per introdurre codoni di arresto prematuri nel gene rbm-3.2, abbiamo progettato un modello di riparazione con le seguenti cinque caratteristiche principali: 1) 35 basi di omologia ininterrotta a rbm-3.2 a monte del codone di avvio rbm-3.2 (braccio omologico sinistro) 2) Un breve tratto di basi contenenti il motivo PAM è stato eliminato 3) Un sito di restrizione EcoRI è stato introdotto immediatamente dopo il codone di partenza per lo screening 4) Il secondo e il terzo codone di rbm-3.2 sono stati eliminati e tre codoni di stop sono stati introdotti dopo il quinto codone RBM-3.2 per fermare la traduzione dell’mRNA rbm-3.2 5) 35 basi di omologia ininterrotta al primo introne di rbm-3.2 sono state incluse a valle dell’edit (braccio omologico destro) ( Figura1B). La miscela di iniezione per questo esperimento CRISPR è stata preparata come indicato nella Tabella I. La miscela di iniezione è stata incubata a 37 °C per 15 minuti per assemblare complessi di ribonucleoproteine. La miscela è stata quindi centrifugata e caricata nell’ago di microiniezione tirato. La microiniezione nella gonna di C. eleganè stata eseguita come descritto in Iyer et al. 201943. La Figura 2 illustra la linea temporale sperimentale per la generazione di C. elegan modificati utilizzando questo protocollo. Sebbene in genere iniettiamo 30 vermi per ogni esperimento CRISPR, alcuni laboratori iniettano meno vermi (tra 10 e 20) per ogni esperimento CRISPR. Poiché l’iniezione di più worm aumenta la probabilità di trovare modifiche positive, preferiamo iniettare un numero maggiore di worm. Molti laboratori scelgono covate “jackpot” (piatti con progenie Rol e Dpy superiori al 50%) per lo screening. Nella nostra esperienza dopo aver eseguito diversi esperimenti CRISPR, anche se le covate del jackpot sorgono occasionalmente, la maggior parte delle volte, i vermi Rol che vengono raccolti per lo screening spesso provengono da molte diverse piastre P0, ognuna composta da pochi discendenti di Rol. In questo esperimento non sono state ottenute covate con jackpot. In totale, abbiamo esaminato il DNA genomico di 73 vermi F1 Rol ottenuti da 7 vermi P0 iniettati per la presenza del montaggio. Le sequenze dei primer di screening e le loro posizioni rispetto al codone iniziale del gene rbm-3.2 sono rappresentate in Figura 3A. Attraverso la nostra analisi, 7 dei 73 worm F1 sono risultati positivi per la modifica (9,5%) ( Figura3B). Vermi non inediti hanno mostrato un singolo frammento di DNA di 445 bp durante la digestione di EcoRI. Mentre, i vermi portatori di un codone di arresto prematuro nel gene rbm-3.2 hanno mostrato due frammenti di 265 bp e 166 bp rispettivamente sulla digestione ecoRI. I vermi eterozigoti hanno mostrato tre frammenti durante la digestione di EcoRI: un frammento di DNA non modificato di tipo selvatico di 445 bp e due frammenti di DNA di 265 bp e 166 bp rispettivamente dalla copia modificata del gene rbm-3.2. Per identificare i vermi portatori di modifiche omozigoti, abbiamo trasferito 12 vermi F2 dagli eterozigoti F1 positivi identificati su nuove piastre individuali e abbiamo permesso loro di produrre progenie (F3). I vermi F2 sono stati quindi sottoposti a screening per l’omozigosi come descritto in precedenza. 6 su 12 (50%) worm sottoposti a screening sono risultati omozigoti per la nostra modifica di interesse (Figura 4A). Il DNA genomico di una linea di vermi omozigoti identificata è stato utilizzato per impostare una reazione di sequenziamento del DNA. L’analisi del sequenziamento del DNA ha confermato la presenza dell’edit nel suo stato omozigote (Figura 4B). In generale, è utile sequenziare più linee di worm omozigoti per garantire che tutte le linee di worm modificate omozigoti presentino lo stesso fenotipo (se la mutazione nulla produce un fenotipo specifico). Inoltre, potrebbe anche essere necessario convalidare i knockout genici utilizzando un test basato sull’espressione come western blotting o RT-PCR o tramite analisi fenotipo. Questo perché, nonostante l’introduzione di codoni di arresto prematuri all’inizio del gene, un ATG alternativo potrebbe essere presente a valle dei codoni di arresto prematuro. Questo ATG potrebbe essere utilizzato per avviare l’espressione proteica, risultando in una proteina troncata parzialmente funzionale. Reagente Concentrazione Volume da aggiungere Proteina Cas9 in acqua priva di nucleasi con 20% di glicerolo 2 μg/μL 5 μL tracrRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5 4 μg/μL 5 μL dpy-10 crRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 0,4 μL rbm-3,2 crRNA in 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 1 μL modello di riparazione dpy-10 in acqua sterile priva di nucleasi 500 ng/μL 0,55 μL rbm-3.2 modello di riparazione in acqua sterile priva di nucleasi 1 μg/μL 2,2 μL KCl in acqua sterile priva di nucleasi 1 M 0,5 μL acqua sterile priva di nucleasi – 5,35 μL Tabella 1: Componenti della miscela di iniezione per l’editing CRISPR/Cas9 utilizzando complessi di ribonucleoproteine e dpy-10 come marcatore co-CRISPR. Utilizzare tecniche sterili e reagenti privi di RNasi durante la miscelazione di iniezione. Si prega di notare che per fare la miscela di iniezione è stata utilizzata acqua sterile, non deperata senza DEPC. Reagente Concentrazione Volume da aggiungere Kcl 1 M 5 ml Tris-HCl pH 8,3 1 M 1 ml MgCl2 1 M 250 μL NP-40 (o IGEPAL CA-630) 100% 450 μL Interpolazione-20 100% 450 μL Gelatina 2% 500 μL Acqua – 92,35 ml Tabella 2: Ricetta tampone di lisi del verme. Il tampone di lisi del verme può essere prodotto alla rinfusa, autoclavato, filtrato e aliquotato per la conservazione a lungo termine (NOTA: il tampone di lisi può essere conservato per oltre un anno a temperatura ambiente). Aggiungere una diluizione 1:100 di 20 mg/mL di proteinasi K al tampone di lisi del verme appena prima di ogni utilizzo. Figura 1: Schema che mostra crRNA e progettazione del modello di riparazione per rbm-3.2 arresto prematuro CRISPR. Schematicoche mostra i filamenti codificanti e modello del gene rbm-3.2 con la sequenza crRNA e la sequenza del motivo PAM situata sul filamento modello. B.Schema che rappresenta le diverse caratteristiche del modello di riparazione che è stato sintetizzato per introdurre tre codoni di arresto prematuro nel gene rbm-3.2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Timeline sperimentale per la generazione di C. elegans omozigoti mediante editing CRISPR/Cas9 utilizzando complessi di ribonucleoproteine preassemblati e dpy-10 come marcatore co-CRISPR. Una ripartizione giornaliera dei passaggi che devono essere eseguiti per generare C. elegan modificati omozigoti utilizzando questo metodo di editing CRISPR / Cas9. In breve, 30 vermi sono stati iniettati con il mix di editing CRISPR utilizzando la microiniezione e segregati su singole piastre MYOB seminate con OP50 E. coli. Dopo 24 ore, i vermi P0 iniettati sono stati trasferiti su nuove piastre MYOB fresche e autorizzati a continuare a deporre le uova. Nei giorni 3 e 4 dopo la microiniezione, le piastre sono state esaminate per la presenza di vermi Rol F1. Le piastre con il numero massimo di vermi Rol e Dpy F1 sono state selezionate e 73 vermi F1 Rol (di solito scegliamo tra 50 e 100 vermi F1 Rol per esperimento CRISPR) sono stati individuati su nuove piastre MYOB individuali (1 verme per piastra) e autorizzati a deportare le uova per circa 2 giorni. Il giorno 6 dopo la microiniezione, i lasati di verme sono stati preparati dai vermi F1 che avevano prodotto progenie (F2) e sono stati sottoposti a screening per la presenza del montaggio mediante PCR seguita da digestione di restrizione con EcoRI e elettroforesi su gel di agarose. Il giorno 7, 12 vermi non-Rol, non-Dpy F2 sono stati trasferiti dalle piastre positive su nuove piastre individuali e autorizzati a produrre progenie (F3). Il giorno 9, i worm F2 sono stati sottoposti a screening per l’omozigosi della modifica come descritto in precedenza. Il giorno 10, la lisi dei vermi, la PCR e la pulizia PCR sono state eseguite per i vermi Omozigoti F3 e la concentrazione di DNA è stata misurata utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Il giorno 11, le reazioni di sequenziamento Sanger sono state impostate per i campioni positivi e le reazioni sono state inviate per il sequenziamento del DNA. Il giorno 12, i risultati del sequenziamento sono stati analizzati e la presenza del montaggio è stata verificata utilizzando un software di analisi della sequenza (ad esempio il visualizzatore di sequenze CLC). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Screening per C. elegans eterozigoti per i codoni di arresto prematuro rbm-3.2. Immagini di elettroforesi su gel di agarose del DNA genomico PCR di C. elegans digerito con EcoRI. 73 singoli worm F1 sono stati genotipizzati e sottoposti a screening per la presenza del rbm-3.2 edit. I numeri rossi e gli asterischi indicano i worm modificati positivamente. Tutti i 7 C. elegans identificati erano eterozigoti per la modifica in quanto mostravano un frammento di DNA inedito di tipo selvaggio di 445 bp e due frammenti di DNA di 265 bp e 166 bp rispettivamente dalla copia modificata del gene rbm-3.2 durante la digestione ecoRI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Identificazione e verifica di C. elegan modificati omozigoti che trasportano i codoni di arresto prematuro rbm-3.2. A. Screening per C. elegans che sono omozigoti per i codoni di arresto prematuro rbm-3.2 . Immagini di elettroforesi su gel di agarose del DNA genomico di C. elegans digerito con EcoRI. 12 singoli vermi F2 da piastre positive sono stati genotipizzati e sottoposti a screening per l’omozigosi del rbm-3.2 edit. Rosso: vermi modificati omozigoti. 6 dei 12 vermi F2 sottoposti a screening (50%) erano omozigoti per i codoni di arresto prematuro rbm-3,2. Nessun prodotto PCR era presente per il worm 7. B. Conferma dell’inserimento dei codoni di arresto prematuro in rbm-3.2 mediante sequenziamento del DNA. Schema che mostra il confronto tra DNA e sequenze proteiche di omozigoti inediti e modificati. L’analisi dei risultati del sequenziamento del DNA genomico da vermi omozigoti ha confermato la presenza dei tre codoni di arresto prematuro nel gene rbm-3.2 dopo l’editing CRISPR / Cas9. Tutti i cambiamenti di aminoacidi risultanti dopo la modifica di CRISPR / Cas9 sono indicati in lettere rosse o asterischi rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Abbiamo usato il protocollo di cui sopra per modificare diversi geni oltre a rbm-3.2. Le nostre efficienze di editing per diversi loci, RNA guida e modelli di riparazione (a singolo filamento e a doppio filamento) sono variate tra il 2% e il 58% (dati non mostrati). Le efficienze di modifica osservate sono paragonabili alle efficienze di modifica precedentemente riportate dal 2% al 70% per questo protocollo27. Abbiamo anche avuto successo nell’usare questa tecnica nel fare delezioni geniche. Utilizzando due crRNA abbiamo sostituito un gene che è vicino a 6 kb di lunghezza con la sequenza codificante per la proteina fluorescente verde (GFP) (dati non mostrati). Per questo esperimento, circa il 14% dei vermi Rol F1 analizzati sono risultati positivi per la delezione e la sostituzione del gene con GFP (dati non mostrati). Tuttavia, sono necessari ulteriori esperimenti per determinare la durata massima delle delezioni e sostituzioni geniche che possono essere eseguite utilizzando questa tecnica.

Questa tecnica può essere utilizzata per effettuare inserimenti che sono di circa 1,6 kb di lunghezza19. Un recente studio ha dimostrato che per effettuare inserzioni di lunghezza superiore a 1,6 kb utilizzando questo protocollo, la generazione di due rotture a doppio filamento e l’utilizzo di modelli di riparazione con bracci di omologia più lunghi possono consentire l’inserimento di frammenti di DNA molto più grandi (~ 10 Kb)28. In alternativa, possono essere eseguiti più cicli di editing genetico con questo protocollo per generare modifiche più grandi. Altri protocolli di editing genico CRISPR/Cas9 basati su plasmidi C. elegans possono anche essere adottati per esperimenti CRISPR che prevedono l’inserimento di frammenti di DNA più grandi di 1,6 kb46,47,48.

Prima di utilizzare questo protocollo per l’editing genetico, è necessario assicurarsi che il gene di interesse non sia collegato al locus dpy-10 sul cromosoma II. Nel caso in cui un gene bersaglio sia collegato a dpy-10, può essere problematico separare la mutazione dpy-10 lontano dalla modifica di interesse. Quindi, nel caso in cui il gene di interesse sia legato al locus dpy-10, altri marcatori co-CRISPR come unc-58 (cromosoma X),unc-22 o zen-4 (cromosomaIV) e ben-1 o pha-1 (cromosoma III) che si trovano su cromosomi diversi possono essere utilizzati24,25,26,28. I dati del laboratorio Meyer dimostrano che le mutazioni ben-1 e zen-4 possono essere utilizzate come marcatori co-CRISPR di successo per lo screening con questo metodo28. Tuttavia, è importante notare che l’uso di zen-4 e pha-1 come marcatori co-CRISPR richiede l’esecuzione dell’esperimento CRISPR in sfondi zen-4 (cle10ts) o pha-1 (e2123ts) non wild-type rispettivamente26,28. Inoltre, gli esperimenti CRISPR che coinvolgono alcuni marcatori co-CRISPR come ben-1 possono richiedere la preparazione di piastre speciali (ad esempio piastre contenenti benzimidazolo)28. Abbiamo utilizzato con successo il marcatore co-CRISPR unc-58 per lo screening delle modifiche positive per un gene collegato al dpy-10 utilizzando questo metodo (dati non mostrati). La mutazione unc-58(e665) conferisce un fenotipo visibile (paralisi) che può essere efficacemente utilizzato per lo screening dei vermi modificati positivamente24. In alternativa, se è disponibile l’accesso a un microscopio fluorescente, un gene gtbp-1 con tag fluorescenti può anche essere utilizzato come marcatore co-CRISPR per questo protocollo19.

Per un’elevata efficienza di editing durante l’utilizzo di questo metodo di modifica del genoma, il sito di modifica deve trovarsi entro 10-30 basi dal sito di taglio Cas9. Se il sito di modifica è a oltre 30 basi di distanza dal sito di taglio Cas9, l’efficienza di editing diminuisce drasticamentedi 19,35,37. Tuttavia, un recente studio del laboratorio Meyer ha dimostrato che la creazione di due rotture a doppio filamento a distanza l’una dall’altra può consentire l’inserimento di modifiche lontane dal sito di taglio Cas9 utilizzando questo protocollo28.

Nel protocollo corrente, il modello di riparazione è stato progettato in modo che tutti e tre i codoni di arresto inseriti appaiano nello stesso frame di lettura. Tuttavia, una strategia alternativa per creare mutanti nulli sarebbe quella di utilizzare una cassetta STOP-IN universale a 43 basi che è stata descritta in precedenza50. È importante sottolineare che questa cassetta ha codoni di arresto in tutti e tre i possibili fotogrammi di lettura e causa mutazioni di frameshift. Questa è una strategia particolarmente utile per generare mutanti nulli quando si verifica una riparazione impropria o incompleta nel sito di modifica.

In conclusione, a causa della sua breve durata e dei recenti progressi in questo metodo, questo è un metodo eccellente per esperimenti di laboratorio di routine che prevedono l’aggiunta di brevi tag epitopi immunogenici, tag fluorescenti, delezioni geniche, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell’Università di Tulsa (TU) e dalla TU Faculty Development Summer Fellowship assegnata a Jyoti Iyer. Vorremmo ringraziare il Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) e il Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) per aver assegnato stipendi agli studenti coinvolti in questo studio. Vorremmo ringraziare la signora Caroline Dunn per la sua assistenza tecnica. Infine, vorremmo ringraziare i dottori Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter e Saili Moghe per i loro commenti critici su questo manoscritto.

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
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Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).
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