닭 배아망막에서 콘 세포 상호 작용에 로드를 연구하는 원뿔 농축 배양

이 프로토콜은 피에르 대학과 마리 퀴리 대학과 연구의 프랑스 사역의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다 (허가 번호: APAFIS #1028 2015070211275177). 동물 실험은 다음과 같은 승인하에 수행되었다: “인증 d’autorisation d’expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture 드 경찰 드 파리 (11 월 9 일 2011- 11 월 8 일 2016)”. 1. 수정란의 인큐베이션 공업 부화장에서 자연적으로 획득한 주간 수정란(균주 I 657, 빨간 라벨)을 수집합니다. 암탉에 의해 “누워”된 후 실험실에서 수정 란 (생물학적 제로)을 유지하십시오. 각 문화에 대해, 20°C에서 24시간 동안 7개의 수정란을 배양한 다음 37°C에서 136시간 동안 간헐적으로 경사를 되찾은 다음(한쪽에서 반대방향으로 2시간 동안 의진보운동, 4시간 주기)을 습한 챔버에서 배양한다. 2. 닭 배아의 회복 소독제로 7개의 계란의 표면을 씻으시다(예: Pursept A express). 달걀 껍질을 부러 뜨리려면 큰 직선 펜치로 껍질 상단에 구멍을 만듭니다. 그런 다음 껍질을 잘라 서 달걀에서 모자를 제거 하 고 부드러운 삶은 계란으로. 각 배아를 곡면으로 달걀 껍질에서 부드럽게 추출한 다음 멸균 인산염 완충식식염(PBS)을 함유한 페트리 접시로 이전에 37°C로 가열하였다. 부드럽게 배아(초리온 또는 초리오알란토믹 멤브레인)를 둘러싸고 있는 봉투를 제거합니다. 햄버거와해밀턴(42)에대한 시각적 비교에 의해 각 배아의 개발 단계를 확인한다. 발달29단계에서 2개의 배아를 선택한다(그림1). 날개는 팔꿈치에 구부러져 있습니다. 칼라가 눈에 띄게 돋보입니다. 이 법안은 28단계보다 더 두드러지 않습니다. 이러한 선택된 배아의 눈을 이핵화하고 CO2-독립배지(Life technologies)로 이송한다.주의: 배아가 29단계에 있고, 28단계 또는 30단계(도1)에있지 않는 것이 매우 중요합니다. 그래서 두 개의 계란만 마지막으로 사용 되 더라도 적어도 7 개의 계란을 배양 할 필요가 있다. 초리온은 매우 얇기 때문에 구별하기가 어렵지만 배아와 매우 가깝기 때문에 배아를 건드리지 않고 제거해야합니다. 3. 망막의 해부 구부러진 집게로 선택된 배아를 참수하고 방출합니다. 4개의 눈을 CO2-독립배지로 옮기. 이 매체는 0.9 mM CaCl2 및 0.65 mM MgCl 2를 함유하고있다. 각막이 얼굴을 아래로 향하게 하고, 시신경이 실험자가 마주보고 있는 눈을 놓습니다. 두 개의 직선 집게를 사용하여 시신경에 구멍을 뚫습니다. 망막과 안료 상피 사이에 각 집게의 가지를 삽입한다(도2). 각 집게를 당기고 눈을 회전하여 망막에서 상피를 분리합니다. 렌즈와 유리체 다음에 각막을 제거합니다. pH 7.2에서 링거의 매체가 들어있는 페트리 접시에 네 개의 망막을 옮기.주의: 망막만 남아 있는지 확인하고 유리체와 남은 망막 색소 상피의 흔적을 제거하십시오. 4. 망막 세포 현탁액 준비 두 개의 직선 펜치를 사용하여 매우 작은 조각으로 네 개의 망막을 잘라. 링거의 매체로 망막 조각을 두 번 씻으시다. 링거의 매체로 두 번째 세척 후 망막 조각이 튜브 바닥에 떨어지도록하고 링거의 매체를 제거하십시오. 트립신용액(0.25%w/v)으로 37°C에서 20분간 망막 조각을 치료한다. 연속 흡입에 의해 10 분 후에 용액을 분산시하십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 방전하고 망막 조각의 해리를 확인합니다. 10% 불활성화된 태아 종아리 혈청으로 보충된 배양 매체를 추가하여 반응을 중지하십시오. DNase I. DNase I. DNase를 첨가한 직후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 연속흡입 및 방전을 통해 세포 클러스터와 DNA를 분리하여 세포 현탁액을 배양한다. 화학적 정의된 배양 배지(CDCM)로 망막 세포 현탁액을 두 번 세척: 100 μg/mL 리놀레산/BSA로 보충된 덜벡코의 수정된 이글 매체 및 M199 배지의 동일한 부피, 0.86 μM 인슐린, 0.07 μM 이송린, 2.0 μM 프로게스테론, 0.28 μM 프로스타글란딘, 0.29 μM 프로스타글란딘, 0.29 μM Na2SeO3,182 μM putrescine, 3 mM 타우린, 4.7 μM 시티딘 5′-디포스포콜린, 2.7 μM 시티딘 5′-디포스포탄탄, 0.55 μM 하이드로코르티존, 0.03 μM 트리오티로닌, 1mM 나트륨 피루바테 및 20 μM 젠타마이신. 5. 망막 세포 시드 32.25 μg/cm 2의 폴리 L-리신과 함께 37°C에서 2시간 동안 투명한 바닥으로 검은 96웰 배양 플레이트2개를처리한다. M199 배양 배지로 이 플레이트를 두 번 헹구세요. CDCM의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 살아있는 세포를 염색하기 위해 셀 서스펜션 트라이팬 블루의 10 μL의 알리쿼트에 추가합니다. 세포 현탁액 시편을 혈성계(말라세즈의 세포 계수 챔버)에 추가합니다. 현미경의 밑에, 혈액 세포계의 4개의 행에 대하여 염색된 세포를 계산한 다음 1개의 행을 위한 평균 세포 수를 계산합니다 (즉, 40 제곱). 다음과 같은 방법을 적용하여 현탁액의 세포의 농도를 계산합니다: 현탁액의 셀/mL 수 = 연속셀 수(10제곱) x 10은 트라이판 블루 x 1,000을 이용한 혈변세포계 x 희석의 총 제곱 수(셀/mL로 결과를 표현하기 위해). CDCM을 사용하여 세포 현탁액을 두 개의 도금 밀도(1 x 105 셀/cm 2 및 2 x 105 세포/cm2)에 대응하는 2개의 농도(5.6 x 104 셀/mL 및 1.12 x 105 cells/mL)로 셀 현탁액을 가져옵니다. 두 개의 전처리 된 검정 96 웰 배양 판으로 두 세포 현탁액의 종자 50 μL. 플레이트의 오른쪽에서 왼쪽으로 멀티채널 파이펫을 사용하여 플레이트내의 셀을 분배하여 각 컬럼 간에 균질화하여 세포의 분포가 균일하도록 합니다. 분자 라이브러리의 50 μL을 추가합니다(예를 들어, cDNA 라이브러리에서 조건된 매체, 아래 참조)를 미리 정의된패턴(표 1)을사용하여 스크리닝한다. 미디어 변경 없이 5% CO2 에서 37°C에서 7일 동안 플레이트를 배양합니다. 6. 실행 가능한 셀 계산 플레이트의 각 웰에, 칼신 AM의 2.7 μM및 에디듐 호모디머의 0.3 mM을 추가합니다.참고: 칼신은 에디튬 호모디머로서 큰 분자에 침투할 수 없는 세포를 관통합니다. 살아있는 세포의 세포질에서, calcein는 내인성 에스테라아에 의해 가수 분해되고, 485 nm에서 흥분할 때 520 nm에서 방출하여 형광이 된다. 에티듐 호모디머는 죽은 세포에 DNA에 결합. 에티듐 DNA 호모이머 결합은 520 nm에서 흥분 후 635 nm에서 방출되는 적색 형광을 유발합니다. 빛이 없는 경우 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 485와 520nm에서 두 개의 여기 필터가 장착된 반전된 현미경으로 구성된 자동 플레이트 리더기의 형광을 읽고, 520 및 635nm에서 2개의 배출 필터, 목표(x10), 프로세서가 제어하는 전동 스테이지 및 충전 결합 장치 카메라(CCD)를 참조하십시오. 이 카운팅 플랫폼은 변형소프트웨어(19)에의해 제어됩니다. 그것은 잘 A12쪽으로 우물 A1에서 시작하여 96 웰 플레이트의 각 우물에서 동시에 살아있는 세포와 죽은 세포의 형광 심을 획득 할 수 있게하고, B1을 향해 B12, C12등을 향한 C1등(표 I). 음의 대조군(표 I)의 18개의 웰을 사용하여 단일 셀의 평균 면적A를계산합니다. 플레이트의 각 웰에 있는 세포를 계산하고 그 세포 이중 (2개의 세포의 그룹화)이 계산되는 것을 방지하기 위하여 다음 경험적 공식 A x 29/20.7을 적용합니다. 분자별 콘의 보호 효과를 분자별 보호 효과로 점수는 우리가 음의 대조군의 18 개의 우물에서 평균 세포 수 대 분자를 테스트 한 4 우물에서 평균 세포 수 사이의 비율로 (표 1 및 보충 도 1참조). 1 x 105 세포/cm2에서 시드된 플레이트의 결과를 2 x 105 세포/cm2에 시드하여 각 분자에 의한 잠재적 보호(생존율)를 평가한다.