Summary

Selezione ad alto contenuto di differenziazione e analisi della maturazione di colture cellulari precursori di oligodendrociti derivati da cellule staminali neurali fetali e adulte

Published: March 10, 2021
doi:

Summary

Descriviamo la produzione di colture miste di astrociti e cellule precursori di oligodendrociti derivate da cellule staminali neurali fetali o adulte che si differenziano in oligodendrociti maturi e la modellazione in vitro di stimoli nocivi. L’accoppiamento con una tecnica di screening ad alto contenuto basata su cellule costruisce un sistema di screening dei farmaci affidabile e robusto.

Abstract

L’ostacolo principale nello sviluppo di tecniche di screening farmacologico per valutare l’efficacia delle strategie terapeutiche nelle malattie complesse è trovare un equilibrio tra la semplificazione in vitro e la ricreazione del complesso ambiente in vivo, insieme all’obiettivo principale, condiviso da tutte le strategie di screening, di ottenere dati robusti e affidabili, altamente predittivi per la traduzione in vivo.

Nel campo delle malattie demielinizzanti, la maggior parte delle strategie di screening farmacologico si basa su linee cellulari immortalizzate o colture pure di cellule precursori primarie di oligodendrociti (OPC) isolate da animali appena nati, portando a forti pregiudizi dovuti alla mancanza di differenze legate all’età e di qualsiasi condizione patologica o complessità reale.

Qui mostriamo l’impostazione di un sistema in vitro volto a modellare la fisiologica differenziazione/maturazione delle OPC derivate da cellule staminali neurali (NSC), facilmente manipolabili per imitare le condizioni patologiche tipiche delle malattie demielinizzanti. Inoltre, il metodo include l’isolamento dal cervello fetale e adulto, dando un sistema che si differenzia dinamicamente dagli OPC agli oligodendrociti maturi (OL) in una co-coltura spontanea che include anche gli astrociti. Questo modello assomiglia fisiologicamente al processo di mielinizzazione mediata dall’ormone tiroideo e al processo di riparazione della mielina, consentendo l’aggiunta di interferenti patologici che modellano i meccanismi della malattia. Mostriamo come imitare i due componenti principali delle malattie demielinizzanti (cioè ipossia / ischemia e infiammazione), ricreando il loro effetto sulla mielinizzazione dello sviluppo e sulla riparazione della mielina adulta e prendendo in considerazione tutti i componenti cellulari del sistema in tutto, concentrandoci sulla differenziazione delle OPC.

Questo modello misto spontaneo, abbinato a tecnologie di screening ad alto contenuto cellulari, consente lo sviluppo di un sistema di screening farmacologico robusto e affidabile per strategie terapeutiche volte a combattere i processi patologici coinvolti nella demielinizzazione e nell’indurre la rimielinizzazione.

Introduction

Nel sistema nervoso centrale (SNC), le cellule che formano la mielina (oligodendrociti, OL) e i loro precursori (cellule precursori degli oligodendrociti, OPC) sono responsabili della mielinizzazione dello sviluppo, un processo che si verifica durante i periodi peri- e post-natale, e del turnover e della riparazione della mielina (rimielinizzazione) in età adulta1. Queste cellule sono altamente specializzate, interagiscono anatomicamente e funzionalmente con tutte le altre componenti gliali e neuronali, rendendole una parte fondamentale della struttura e della funzione del SNC.

Gli eventi demielinizzanti sono coinvolti in diverse lesioni e malattie del SNC2e agiscono principalmente su OPC e OL attraverso meccanismi multifattoriali, sia durante lo sviluppo che in età adulta. I precursori indifferenziati sono guidati da fattori differenzianti, principalmente l’ormone tiroideo (TH), in un processo sincronizzato3 che porta l’OPC a riconoscere e rispondere a stimoli specifici che inducono proliferazione, migrazione verso l’assone non mielinizzato e differenziazione in OL mature che a loro volta sviluppano la guaina mielinica4. Tutti questi processi sono finemente controllati e si verificano in un ambiente complesso.

A causa della natura complessa degli eventi di mielinizzazione, rimielinizzazione e demielinizzazione, c’è un grande bisogno di un metodo in vitro semplificato e affidabile per studiare i meccanismi sottostanti e sviluppare nuove strategie terapeutiche, concentrandosi sul principale attore cellulare: l’OPC5.

Affinché un sistema in vitro sia affidabile, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori: la complessità dell’ambiente cellulare, le differenze intrinseche cellulari legate all’età, la differenziazione fisiologica mediata da TH, i meccanismi patologici e la robustezza dei dati6. In effetti, il bisogno insoddisfatto sul campo è un modello che imita la complessità della condizione in vivo, non raggiunta con successo attraverso l’uso di colture OPC pure isolate. Inoltre, le due componenti principali degli eventi demielinizzanti, infiammazione e ipossia/ischemia (HI), coinvolgono direttamente altre componenti cellulari che possono influenzare indirettamente la fisiologica differenziazione e maturazione delle OPC, aspetto che non può essere studiato in modelli in vitro eccessivamente semplificati.

Partendo da un sistema di cultura altamente predittivo, la sfida successiva e più generale è la produzione di dati robusti e affidabili. In questo contesto, lo screening ad alto contenuto cellulare (HCS) è la tecnica più adatta7, poiché il nostro obiettivo è in primo luogo analizzare l’intera cultura in un flusso di lavoro automatico, evitando il pregiudizio di scegliere campi rappresentativi e in secondo luogo ottenere la generazione automatica e simultanea di dati ad alto contenuto basati su imaging8.

Dato che la necessità principale è quella di raggiungere il miglior equilibrio tra semplificazione in vitro e complessità che imita in vivo, qui presentiamo un metodo altamente riproducibile per ottenere OPC derivate da cellule staminali neurali (NSC) isolate dal proencefalo fetale e dalla zona sub-ventricolare adulta (SVZ). Questo modello in vitro comprende l’intero processo di differenziazione OPC, dal NSC multipotente all’OL maturo/mielinizzante, in modo fisiologico TH-dipendente. La coltura risultante è un sistema dinamicamente differenziante/maturante che si traduce in una co-coltura spontanea costituita principalmente da OPC e astrociti differenzianti, con una bassa percentuale di neuroni. Questa coltura primaria imita meglio il complesso ambiente in vivo, mentre la sua derivazione di cellule staminali consente di eseguire semplici manipolazioni per ottenere l’arricchimento del lignaggio cellulare desiderato.

Al contrario di altre strategie di screening farmacologico che utilizzano linee cellulari o colture pure di OPC primarie, il metodo qui descritto consente lo studio dell’effetto di interferenti patologici o molecole terapeutiche in un ambiente complesso, senza perdere l’attenzione sul tipo di cellula desiderato. Il flusso di lavoro HCS descritto consente un’analisi della vitalità cellulare e delle specifiche di lignaggio, nonché della morte cellulare specifica del lignaggio e dei parametri morfologici.

Protocol

Tutti i protocolli sugli animali qui descritti sono stati eseguiti secondo le direttive del Consiglio della Comunità Europea (86/609/CEE) e sono conformi alle linee guida pubblicate nella Guida NIH per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Soluzioni e reagenti Preparare il mezzo standard: DMEM / F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillina/Streptomicina (1% P/S); 1x B27; 1x N-2. Preparare il mezzo della neurosfera: aggiungere 10 ng/mL di b…

Representative Results

La prima fase della coltura può variare nella durata, a seconda della densità di semina e del fatto che le sfere siano di origine fetale o adulta. Inoltre, le oligosfere mostrano un raddoppio della popolazione ridotto rispetto alle neurosfere (Figura 1B). Inoltre, la produzione di sfere da tessuto adulto è più lenta e possono essere necessarie 2-3 settimane per generare oligosfere rispetto a quelle fetali che possono richiedere 1-2 settimane, a seconda della densità di semina. <p cl…

Discussion

La natura complessa dei processi di mielinizzazione/rimielinizzazione e degli eventi demielinizzanti rende estremamente impegnativo lo sviluppo di sistemi predittivi in vitro. I sistemi di screening farmacologico in vitro più utilizzati sono per lo più linee cellulari umane o colture PRIMARIE di OL puro, con un uso crescente di co-colture più complesse o sistemi organotipici15. Anche se tali sistemi sono accoppiati con tecnologie ad alto contenuto, le colture OL pure rimangono il metodo di scel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sostenuto dal PROGETTO IRMI (CTN01_00177_888744) dei Cluster Tecnologici Nazionali del MIUR e dalla Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.

Un ringraziamento speciale a Fondazione IRET per aver ospitato il lavoro sperimentale.

Materials

96-well plates – untreated NUNC 267313
B27 supplement (100x) GIBCO 17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) GIBCO PHG0024
BSA Sigma-Aldrich A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) GIBCO PHC7015
DMEM w/o glucose GIBCO A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX GIBCO 31331-028
DNase Sigma-Aldrich D5025-150KU
EBSS GIBCO 14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF) GIBCO PHG6045
HBSS GIBCO 14170-088
HEPES GIBCO 15630-056
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
IFN-γ Origene TP721239
IL-17A Origene TP723199
IL-1β Origene TP723210
IL-6 Origene TP723240
laminin GIBCO 23017-051
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165
N2 supplement (50x) GIBCO 17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer GIBCO 13150-016
PBS GIBCO 70011-036
Penicillin / Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) GIBCO PHG0035
poly-D,L-ornitine Sigma-Aldrich P4957
TGF-β1 Origene TP720760
TNF-α Origene TP723451
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2752-1G
Trypsin Sigma-Aldrich T1426

References

  1. Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
  2. Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
  3. Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
  4. Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
  5. Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
  6. Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
  7. Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, 1-80 (2014).
  8. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
  9. Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, 241-252 (2010).
  10. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  11. Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
  12. Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
  13. Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
  14. Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
  15. Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
  16. Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
  17. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
  18. Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
  19. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
  20. Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
  21. Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
  22. Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
  23. Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
  24. Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
  25. Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).

Play Video

Cite This Article
Baldassarro, V. A. High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures. J. Vis. Exp. (169), e61988, doi:10.3791/61988 (2021).

View Video