라이브 이미징을 위한 피브린 혈전을 가진 드로소필라 조직의 정화 응용 프로그램

1. 시약 준비 참고: 달리 설명하지 않는 한 이 프로토콜의 모든 단계는 실온에서 수행됩니다. 1x PBS-BSA(0.1% w/v)의 용액을 준비하려면 PBS 1mL에 소세럼 알부민(BSA)을 1mg용해한다. 혈소판 1,000대·mL-1의 재고용액을 PBS-BSA 1mL(0.1%w/v)에 1,000대 용해한다. 10 μL의 알리쿼트를 만들고 -20°C에서 최대 4개월 동안 보관하십시오. Drosophila 두뇌를 위한 배양 매체를 준비하기 위하여는, 멸균 조건에서 슈나이더의 배지의 1 L에 포도당 1 g를 녹입니다. 최대 3개월 동안 4°C로 걸기 및 보관하십시오. 피브리노겐 용액을 준비하려면 1mL의 배양 배지에 10 mg의 피브리노겐을 실온에서 20분 또는 37°C에서 5분 동안 용해하십시오.참고: 1.2단계에서 제조된 배양 배지와 다른 배양 배지가 사용되고 이 단계에서 이미 형성되는 경우, 배양 배지는 사전에 비활성화되어야 하는 활성 혈전을 포함할 가능성이 있다. Thrombin의 가능성이 소스는 30 분 동안 56 °C에 혈청을 가열하여 비활성화 될 수있는 태아 소 혈청이다. PBS-BSA의 코팅 용액을 준비하려면 (5 % w / v), 1 x PBS의 1 mL에 소 세럼 알부민 (BSA)의 50 mg을 용해하십시오. 4단계에서 사용되는 예시 시약은, 315 μL 디메틸 설프리산화물에서 1 mg NAPP1을 용해시킴으로써 10m NAPP1의 스톡 용액을 준비한다. 2. 드로소필라 애벌레 뇌의 해부 참고: 해부 쌍안경 아래에서 이 단계를 수행합니다. 브러쉬를 사용하여 L3 애벌레를 PBS가 함유된 9웰의 보로실리케이트 유리 접시로 옮길 수 있습니다. 애벌레에서 플라이 푸드의 대부분을 분리하고 배양 배지를 포함하는 다른 우물로 옮기도록 저어주세요. 집게(예: Dumont #55)를 사용하여 몸 길이의 중간에 전체 직경에 걸쳐 애벌레를 잡습니다(그림 1A, B참조). 애벌레를 들고 있는 동안, 신선한 배양 배지의 200 μL을 포함하는 보로실리케이트 플레이트의 또 다른 우물로 옮기다. 애벌레를 방출하지 마십시오. 전체직경(도 1B)에걸쳐 애벌레를 반으로 자르려면, 포셉 팁(도1A,상단 패널)의 측면 이동으로 파악된 영역을 갈기하거나 애벌레를 들고 있는 두 개의 포스프 팁 사이에 다른 한 쌍의 집게를 밀어 넣습니다(도1A,하단 패널). 유충을 반으로 자르지 마십시오, 그것은 신체 길이를 교차 하는 신경을 통해 그것을 당겨 서 뇌를 손상시킬 수 로 (그림 1B의빨간 선). 집게를 사용하여 큐티클과 다른 한 쌍의 포셉으로 유충을 잡고 뇌를 당기지 않고 큐티클을 벗겨냅니다(도1C). 뇌에서 유래하는 신경이 눈에 띄고 뇌를 입 부위에 연결하는 장기가 도 1D에도시된 바와 같이 접근할 수 있을 때까지 반복한다. 집게를 사용하여 뇌에서 유래한 신경을 유지합니다. 다른 쌍의 집게와 함께, 도 1A에 도시된 기술 중 하나를 사용하여 뇌와 입 부위사이의 연결을 잘라내고, 나머지 큐티클(도1D)에서뇌를 분리한다. 복부 신경 코드에서 나오는 축약에 의해 뇌를 유지하기 위해 집게를 사용합니다. 그림 1E에서 회색으로 묘사 된 장기를 부드럽게 뇌에서 끌어 당깁니다.참고: 눈/안테나 상상 디스크(어두운 노란색)를 당겨 뇌에서 분리하지 마십시오. 이 조직 사이 연결은 두뇌를 손상시키지 않고 당겨서 깨질 수 없을 정도로 견고합니다. 여전히 신경을 잡고 뇌를 방향을 잡는 동안, 눈 / 안테나 상상 디스크 (어두운 노란색)와 다른 쌍의 집게(그림 1F)와뇌 사이의 연결을 파악합니다. 도 1A에 표시된 기술 중 하나를 사용하여 뇌를 당기지 않고이 연결을 잘라냅니다. 뇌가 다른조직(도 1G)을적절히 지워지고 손상되지 않았는지 확인합니다(그림1H). 손상의 흔적을 보여주는 경우 뇌를 폐기. 파이펫 팁을 코팅하기 위해 P20안팎으로 코팅 용액을 피펫합니다. 코팅된 팁과 함께 코팅된 팁으로 뇌를 파이펫으로 3 μL(도2A, 왼쪽)과파이펫을 다른 우물에서 피펫하여 깨끗한 배양 배지의 200 μL을 함유하고 있다. 충분한 뇌가 해부될 때까지 2.2-2.8 단계를 반복하여 해부가 수행되는 우물의 배양 매체를 교체합니다. 그림 1: D. 멜라노가스터 애벌레 뇌의 해부. (A)집게를 사용하지 않고 절단하는 기술. 샘플(창백한 녹색)은 집게(상단 패널)의 끝 사이에 접지되거나 샘플을 들고 있는 한 쌍의 집게 팁(아래패널)을 따라 한 쌍의 집게 팁 팁을 실행하여 절단할 수 있습니다. (B–F) 그것을 손상시키지 않고 애벌레 뇌를 격리하기위한 단계 (텍스트 참조). 빨간색: 뇌. 어두운 노란색 : 눈 / 안테나 디스크. 파란색 텍스트: 해당 집게로 수행할 작업입니다. (G)눈에 보이는 손상이없는 고립 된 뇌의 출현. D는 등쪽이고 V는 측면 뷰의 복부 측입니다. (H)해부 동안 뇌를 과도하게 당기는 것으로 인한 일반적인 손상. 상단 패널: 복부 신경 코드의 분리. 하단 패널: 로브변형. 후방은 왼쪽이며 전방은 모든 패널에서 맞습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. 피브린 혈전으로 커버슬립에 대한 고정 참고: 해부 쌍안경 아래에서 이 단계를 수행합니다. 2.8단계와 같이 코팅된 팁이 있는 P20 파이펫을 사용하여 해부된 뇌를 배양 배지 + 피브리노겐(그림2A)의200 μL을 포함하는 보로실리케이트 플레이트의 또 다른 우물로 이송한다. 배양 배지 + 피브리노겐의 9 μL과 함께 한 뇌의 파이펫. 팁의 끝으로 35mm 세포 배양 접시의 커버 유리 바닥을 거의 만지고, 배양 배지가 파이펫 팁을 종료한 직후 커버슬립을 터치하여 뇌와 배지가 팁의 측면으로 미끄러지지 않도록 하여 뇌를 손상시킬 수있습니다(그림 2A). 한 쌍의 집게 또는 닫힌 한 쌍의 집게를 사용하여 배양 배지 + 피브리노겐 드롭 내에서 뇌를 부드럽게 밀고 배치하십시오.참고: 열린 한 쌍의 집게로 드롭을 만지면 배양 배지가 집게팁(도 2B)사이에모세관에 의해 당겨질 수 있습니다. 뇌의 복부 부분을 이미지화해야 하는 경우, 혈전 내뇌를 제대로 방향을 지정하기 위해 다음과 같이 피브리노겐 응고를 유도한다(도2C). 뇌를 드롭의 한쪽으로 밀어 넣습니다. P1 팁, 트롬빈 용액의 파이펫 1 μL이 장착된 P1 파이펫을 사용하여 파이펫 끝으로 뇌의 반대편에 있는 낙하의 가장자리를 터치하고, 트롬빈(도2C,첫 번째 도면)을 피펫으로 처리합니다. 피브리노겐이 중합을 시작할 때까지 1-2분 동안 기다려, 낙하의 한쪽에서 흐린 침전물의형성(도 2C,두 번째 도면). 부드럽게 밀고 “턱”피브린 응고에 뇌를,이미지에 부분 (예를 들어, 복부 측) 뇌를 변형하지 않고 커버 슬립에 가능한 한 가까운 있는지 확인(그림 2C,세 번째 도면). 피브린 응고에 들어가지 않는 뇌의 측면에 가까운 Thrombin 용액의 1 μL을 피펫. (그림2C,네 번째 도면). 두 번째 피브린 응고가 설정될 때까지 2-3분기다립니다(그림 2C,다섯 번째 도면). 혈전의 가장자리를 눌러 커버슬립을 더 강하게 부착하여 뇌를 변형시키지 않도록 주의하십시오(그림2C,제6 및 일곱 번째 도면). 뇌가 커버슬립에서 너무 멀리 떨어져 있는 것처럼 보이는 경우, 뇌에 가까운 피브린 응고를 눌러 더 가까이 가져. 뇌의 등쪽 부분을 배화해야 하는 경우 다음과 같이 피브린 응고를 유도한다(도2D). 커버슬립을 향한 등쪽 부분의 중앙에 뇌를 배치합니다. 얇은 팁, 트롬빈 용액의 파이펫 1 μL이 장착된 P10 파이펫을 사용하여 파이펫 끝으로 뇌의 반대편에 있는 낙하의 가장자리를 터치하고, 트롬빈(도2D,첫 번째 도면)을 피펫으로 한다. 피브리노겐이 중합을 시작하기위해 2-3분 동안 기다린후 흐린 섬유침(도2D,제2도면)의 형성을 초래한다. 혈전의 가장자리를 눌러 커버슬립을 더 강하게 부착하여 뇌를 변형시키지 않도록 주의하십시오(그림2D,세 번째 및 네 번째 도면). 여러 응고 샘플이 커버슬립에 고정되어야 하는 경우 3.1-3.5 단계를 반복합니다. 팁의 끝으로 응고 위에 약 0.5cm 위치, 부드럽게 파이펫 390 혈전 의 상단에 피브리노겐 드롭 없이 배양 매체의 μL(그림 2B,오른쪽 페트리 접시). 커버슬립에서 분리될 수 있으므로 응고 의 측면에 배양 배지를 추가하지 마십시오. 나머지 Thrombin을 씻어내려면 파이펫을 사용하여 배양 배지의 300 μl을 제거하고 깨끗한 배양 배지300 μl을 추가하여 혈전이 완전히 침지되도록 합니다. 초과 트롬빈을 씻어 두 번 반복합니다. 그림 2: 피브린 혈전을 사용하여 드로소필라 애벌레 뇌의 고정화. (A)BSA 코팅 파이펫 팁을 사용하여 뇌는 배양 배지(노란색)에서 배양 배지 + 피브리노겐 용액(orange)으로 옮겨진 다음 문화 배지 + 피브리노겐3.5 μL과 함께 문화 접시의 커버슬립(light blue)에 파이펫을 넣습니다. 피브리노겐 응고는 등대 또는 복부 위치에 있는 두뇌를 고정하기 위하여 Thrombin의 추가에 의해 유도됩니다 (D 및 E참조). 혈전의 확보된 뇌는 이후 피브리노겐이 없는 배양 배지로 덮여 있으며, 과잉 혈소판은 배양 배지를 3번 첨가및 제거하여 제거된다. (B)커버슬립에 배양 배지 + 피브리노겐(주황색)의 드롭 내뇌의 위치는 닫힌 한 쌍의 집게 또는 단 하나의 포셉 팁으로 부드럽게 밀어서만 조절되어야 한다. 집게의 열린 쌍에 드롭을 터치하면 배양 매체가 집게의 끝 사이에 모세관에 의해 당겨질 수 있습니다. (C)복부 측을 이미징하기 위한 애벌레 뇌의 위치를 위한 단계(텍스트 참조). (D)등쪽 측을 이미징하기 위한 애벌레 뇌를 포지셔닝하는 단계(텍스트 참조). (D)및(E),녹색: 트롬빈. 다크 오렌지: 피브린 응고. 옅은 파란색 : 커버 슬립. 파란색 화살표: 응고를 안정화하기 위해 덮개 슬립에 밀어붙일 응고의 가장자리입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 4. 라이브 이미징 중 시약 추가 초점의 변화를 일으키는 온도 변화를 방지하기 위해, 시약을 사용하여 용액을 배양 접시 자체와 동일한 온도로 배양 접시에 첨가하여 추가하기 전에 동일한 온도로 가져 오십시오. 환경 챔버를 사용하는 경우 챔버 내에 솔루션을 둡니다. 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시의 뚜껑을 제거합니다. 쉽게 제거할 수 있도록 35mm 접시 뚜껑을 이미지 촬영 하기 전에 접시 위에 거꾸로 놓습니다. P1000 파이펫을 사용하면 배양 접시 내부의 배양 배지 표면에 피펫 팁을 배치하고 원하는 시약 농도(예: 20 μM NAPP1의 용액의 400 μL을 10μM NAPP1의 최종 농도를 위한 배양 배지의 400 μL)에 도달하기 위해 적절한 시약 용액을 부드럽게 방출합니다. 혈전을 분리할 수 있는 강한 플럭스를 생성하지 않고. 배양 접시 내에서 용액을 균질화하려면 P200 파이펫을 사용하여 소량의 용액을 5배(예: 접시 내에서 800 μL의 부피에 150 μL)로 천천히 피펫합니다. 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시 위에 뚜껑을 교체하고 이미징을 다시 시작합니다. 5. 라이브 이미징 중 시약 세척 세척 전에, 문화 접시와 같은 온도에서 세척 용액을 유지합니다. 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시의 뚜껑을 제거합니다. P200 또는 P1000 파이펫을 사용하면 혈전 의 상단을 노출하지 않고 배양 접시에서 일부 배양 배지를 천천히 제거합니다(예: 접시 내의 배양 배지 800 μL에서 600 μL제거). 시약을 희석시키기 위해 P1000 파이펫으로 배양 식 배지의 표면에 파이펫 팁을 배치하고 세척 용액을 천천히 방출합니다(예를 들어, 6의 희석 계수를 위해 접시 내에 남은 배양 배지의 200 μL에 1mL의 세척 용액을 추가). 시약이 필요에 따라 희석될 때까지 5.3 및 5.4단계를 반복합니다(예를 들어, 또 다른 3개의 유사한 라운드는 1296의 희석계수를 초래하여 10 μM NAPP1에서 7.7nM의 초기 농도를 감소시킵니다). 문화 접시 자체를 대체하지 않고 문화 접시 위에 뚜껑을 교체하고 이미징을 다시 시작합니다. 6. 삼차원 및/또는 멀티채널 시간 경과에 표류하는 xyz의 보정 준비 다운로드 및 설치 ImageJ24. 터보 레그25 및 멀티 스택Reg26 플러그인을 다운로드하고 ImageJ의 플러그인 폴더 안에 배치합니다. 멀티하이퍼스택Reg(추가코딩 파일 1)및 자동하이퍼스택레그 이미지J 매크로(추가코딩 파일 2)를다운로드합니다. 매크로를 설치하려면 ImageJ의 플러그인 폴더 안에 .ijm 파일을 배치하거나 ImageJ/매크로/StartupMacros.txt 파일에 .ijm 파일의 내용을 추가합니다. ImageJ에서 여러 조각 및/또는 여러 채널을 포함한 타임랩스 영화를 엽니다(이제부터는 “하이퍼스택”, 그림 3A,4A라고함). 시간 경과에 하나의 슬라이스와 하나의 채널만 포함된 경우 MultiStackReg를 사용하여 정렬을 직접 수행할 수 있습니다. 멀티하이퍼스택레그 사용 측면 드리프트 수정 하이퍼스택의 채널 및/또는 슬라이스를 정렬을 위한 참조로 사용해야 하는지 결정합니다. 한 채널, 한 슬라이스 참조 스택(“참조 스택”이라고 함)을 생성하려면 이미지 | 클릭하십시오. 중복…중복 하이퍼 스택 확인란을 선택, 채널 (c)에서 관련 채널 번호를 입력: (예를 들어, 1-2와 1로교체) 및 /또는 슬라이스의 관련 채널 번호 (z): (예를 들어, 1-15를 8로대체), 프레임 (예를 들어, 1-50)클릭하기 전에 모든 프레임 (예를 들어, 1-50)을 포함되도록 (그림 3B). 또는 6.2.1 단계, 한 채널, 한 슬라이스 참조 스택에 대해 여러 슬라이스의 투영이 바람직하다면 이미지를 클릭| 스택 | Z 프로젝트 …- 모든 시간 프레임이 틱되어 확인을 클릭, 첫 번째 및 마지막 조각과 프로젝션의 유형을 선택합니다. 시간 경과에 관련없는 채널을 삭제하는 채널이 여러 개인경우(이미지 | 스택 | 결과 투영에서 슬라이스를 삭제하거나 선택한 참조 채널을복제(이미지 | 중복)(그림 3B). 선택적으로, 참조 스택을 자르기 위해 도구 모음의 사각형 도구를 선택하고 관심 영역을 통해 사각형을 추적하고 이미지를 클릭하여 하나의 부품만 참조로 사용| 자르기. 멀티 스택레그를 시작하려면 플러그인 | 클릭하십시오. 등록 | 멀티 스택레그. 팝업 메뉴 스택 1에서: 이전 단계에서 생성 된 하나의 채널, 한 슬라이스 스택의 이름을 선택합니다. 팝업 메뉴 변환에서 : 번역을선택 ; 변환 파일 저장 확인란을 선택하여 다른 모든 필드를 무시합니다.참고: 다른 유형의변환(참조 25). 확인을 클릭합니다. 정렬 파일을 저장하려면 위치와 이름을 선택하고 저장을 클릭합니다. 참조 스택 창에서 프레임이 자동으로 이동을 중지할 때까지 기다렸다가 등록이 끝났음을나타냅니다(그림 3B). 참조 스택을 확인하여 정렬이 만족스러운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 다른 참조 슬라이스, 채널 및/또는 자르기로 6.2.1-6.2.5 단계를 반복합니다. 참조 스택을 닫습니다. 하이퍼스택 창을 선택하고 MultiHyperStackReg 매크로를 실행합니다. 6.2.5 단계에서 생성된 변환 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다. 정렬이 하이퍼 스택의 모든 채널 및/또는 슬라이스에 적용될 때까지 기다립니다.이 시점에서 접미사 “_aligned”이 있는 새 창이열립니다(그림 3C). 멀티하이퍼스택레그 사용 초점 드리프트 수정 이미지 | 클릭 속성… 1픽셀 간격으로 1채널 하이퍼스택을 직교적으로 다시 슬라이스하려면 이미지 | 스택 | [/]… 시작 시 상단을 선택: 팝업 메뉴, 체크 보간 방지 및 확인을클릭합니다.참고: ImageJ에서 메모리를 해제해야 하는 경우 다시 슬라이스한 후 하이퍼스택을 닫을 수 있습니다. 다시 슬라이스에 의해 생성 된 새 창을 선택합니다 (이제부터 “다시 슬라이스 된 하이퍼 스택”, 그림 4B라고함). 다시 슬라이스된 하이퍼스택에 여러 채널이 있는 경우 참조 채널을 선택하여 정렬을 수행하고 채널 스크롤 막대에서 다른 채널을 선택하여 다른 채널을 삭제합니다. 이미지 | 클릭 스택 | 슬라이스 삭제,현재 팝업 삭제 메뉴에서 채널을 선택하고 확인을 클릭합니다. 다시 슬라이스된 하이퍼스택(이후부터는 “다시 슬라이스된 참조 스택”이라고 함)을 생성하거나, 다시 슬라이스된 하이퍼스택의 단일 슬라이스(6.2.1 참조) 또는 리슬라이스하이퍼스택의 여러 조각을 투영하여(단계 6.2.2 참조)(그림 4C참조). 선택적으로, 다시 슬라이스 된 참조 스택을 자르기 위해 하나의 부분을 참조로 사용하여 (단계 6.2.3 참조). MutiStackReg를 사용하여 다시 슬라이스된 참조 스택에서 이미지 등록을 수행합니다(단계 6.2.4-6.2.6)(그림 4C참조). 다시 슬라이스된 하이퍼스택 창을 선택하고 MultiHyperStackReg 매크로를 실행합니다. 6.3.5 단계에서 생성된 변환 파일을 선택하고 열기를 클릭하고 하이퍼스택의 모든 채널 및/또는 슬라이스에 정렬이 적용될 때까지 기다립니다.이 시점에서 접미사 “_aligned”이 있는 새 창이 열립니다(이후부터는 “다시 슬라이스된 참조 스택”, 그림 4D라고함). 원래 다시 슬라이스된 하이퍼스택을 닫습니다. 다시 슬라이스된 정렬된 하이퍼스택을 원래 하이퍼스택의 xy 뷰로 변환하려면 스택 | 클릭합니다. [/]… 최종 초점 정렬 하이퍼스택이 열리는 새창(그림 4E)이다시 슬라이스된 정렬된 하이퍼스택을 닫습니다. 횡표류및 초점 드리프트를 자동으로 수정하려면 AutoHyperStackReg 매크로를 실행합니다. 참조 채널,해당하는 경우 및 측면 및/또는 포커스 드리프트를 수정할지 여부를 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 그림 3: 멀티하이퍼스택레그와 측면 드리프트의 보정을 위한 파이프라인. (A)측면 및 초점 드리프트는 여러 조각과 타임포인트를 포함하는 하이퍼스택에서 관찰될 수 있다. (B)단일 슬라이스, 단일 채널 참조 스택은 중복 또는 Z 프로젝션에 의해 하이퍼스택으로부터 생성된다. 참조 스택은 MultiStackReg 플러그인에 의해 정렬되어 정렬 파일을 생성합니다. (C)MultiHyperstackReg 매크로는 하이퍼 스택에 정렬 파일을 적용하는 데 사용되며, 그 결과 측면 드리프트가 수정되는 정렬된 하이퍼스택이 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 멀티하이퍼스택레그와 초점 드리프트의 보정을 위한 파이프라인. (A)여러 슬라이스와 타임포인트를 포함하는 하이퍼스택에서 초점 드리프트를 관찰할 수 있다. (B)하이퍼스택은 보간 없이 Y축을 따라 각 픽셀 라인을 따라 맨 위에서 직교로 다시 슬라이스됩니다. 이렇게 하면 하이퍼스택과 동일한 정보가 포함된 다시 슬라이스된 하이퍼스택이 생성되며 y 및 z 좌표가 전환됩니다. 원래 하이퍼스택의 초점 드리프트(z)는 다시 슬라이스된 하이퍼스택에서 y의 드리프트로 발생합니다. (C)단일 슬라이스, 단일 채널 재슬라이스 기준 스택은 복제 또는 Z 프로젝션에 의해 다시 슬라이스된 하이퍼스택으로부터 생성됩니다. 다시 슬라이스된 참조 스택은 MultiStackReg 플러그인에 의해 정렬되어 정렬 파일을 생성합니다. (D)MultiHyperstackReg 매크로는 재슬라이스된 하이퍼스택에 정렬 파일을 적용하는 데 사용되며, 그 결과 초점이 (y)에서 리딩되는 정렬된 하이퍼스택이 생성됩니다. (E)두 번째 직교 재슬라이스는 하이퍼 스택의 원래 좌표를 복원하여 이제 더 이상 초점 드리프트(z)를 제공하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 7. 회전 라인 스캔을 통해 피질 신호 측정 회전 라인 스캔 ImageJ 매크로(보충 코딩 파일 3)를다운로드합니다. ImageJ에서 시간 경과를 엽니다. 프레임 스크롤 모음을 첫 번째 프레임에 배치하고 시간 경과에 여러 조각이 포함된 경우 슬라이스 스크롤 모음을 신호가 측정되는 슬라이스로 배치합니다. 추적 모드 도구 모음에서 직선 도구를 선택합니다. 측정할 피질영역(그림 5A)을가로질러 선을 추적하여 선이 피질에 대략 수직이고 선이 다음 시간마다 피질을 교차할 만큼 충분히 길다는 것을 확인합니다(그림5B, 제1 및 제2 패널). 도구 모음에서 줄 도구 아이콘을 두 번 클릭하여 선 너비 창을 엽니다. 선과 피질 사이의 교차를직선(도 5B, 제3 패널)으로유지하면서 필요에 따라 선의 폭을 늘립니다. 회전 선스캔 매크로를 시작합니다. 측정할 피질 영역의 방향이 한 시점에서 다음 시간대로 크게 변경되지 않는 경우 회전범위(도 5E)를낮은 값(약 10°)으로 설정합니다. 측정 값값을 0픽셀로 설정하여 최대 신호 강도가 감지되는 선의 신호만 측정하거나 이 선 주위의 신호를 측정하기 위해 더 높은 값으로만 측정합니다.참고: 측정 주변 값은 피질을 감지한 후 신호 측정에만 영향을 미치며 검출 자체에영향을 미치지 않습니다. 채널의 피질 찾기: 팝업 메뉴에서 감지가 수행되는 채널을 선택합니다. 각 시점에서 피질이 감지된 위치를 시각화하려면 표시 위치를 선택합니다. 리센터(Recenter)를 유지하고 확인란을 체크박스로 조정합니다. 확인을 클릭합니다. 완료되면 클립보드 상태로 복사된 결과가 ImageJ 창 상태에 표시되고 시간 경과를 스크롤하여 감지된 피질 위치(노란색 오버레이)와 측정영역(시안 오버레이)이 만족스러운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 회전 선 검색 옵션 창에서 다른 라인 위치, 길이 또는 너비 및 다른 설정으로 7.3.1-7.3.4 단계를 반복합니다. 측정값을 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다.참고: 열은 시간 경과및 선에서 나타나는 순서대로 채널에 해당하며 선은 프레임에 해당합니다. 추적 금지 모드 도구 모음에서 직선 도구를 선택합니다. 측정할 피질 영역을 가로질러 선(시안, 도 5A에표시)을 추적하여, 라인이 피질에 대략 수직이고 라인이 매 시(그림5C, 제1 및 제2 패널)에서피질을 교차할 만큼 충분히 길다는 것을 확인합니다. 도구 모음의 줄 도구 아이콘을 두 번 클릭하여 선 너비 창을 엽니다. 선과 피질 사이의 교차를직선(도 5C, 제3 패널)으로유지하면서 필요에 따라 선의 폭을 늘립니다. 회전 선스캔 매크로를 시작합니다. 전체 타임랩스 전반에 걸쳐 측정되는 피질 영역의 방향 변화에 따라 회전범위(도 5E)를설정합니다. 측정 값값을 0픽셀로 설정하여 최대 신호 강도가 감지되는 선의 신호만 측정하거나 이 선 주위의 신호를 측정하기 위해 더 높은 값으로만 측정합니다.참고: 측정 주변 값은 피질을 감지한 후 신호 측정에만 영향을 미치며 검출 자체에영향을 미치지 않습니다. 채널의 피질 찾기: 팝업 메뉴에서 감지가 수행되는 채널을 선택합니다. 각 시점에서 피질이 감지된 위치를 시각화하려면 디스플레이 위치를 선택합니다. 리센터 및 리오리엔테이션 을 선택 해제… 확인을 클릭합니다. 완료되면 클립보드에 복사된 결과가 ImageJ 창 상태에 표시되고, 경과를 스크롤하여 감지된 피질 위치(노란색 오버레이)와 측정된 영역(시안 오버레이)이 만족스러운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 회전 선 검색 옵션 창에서 다른 줄 위치, 길이 또는 너비 및 다른 설정으로 이전 단계를 반복합니다. 측정값을 스프레드시트 소프트웨어에 붙여넣습니다.참고: 열은 시간 경과및 선에서 나타나는 순서대로 채널에 해당하며 선은 프레임에 해당합니다. 그림 5: 회전 라인칸으로 피질 신호 측정. (A)신호가 측정되는 피질(black)에 수직으로 추적되는 선(cyan). 회색의 다른 음영은 세 시간 (t1, t2, t3)를 통해 변화하는 셀 위치를 보여줍니다. (B)왼쪽: 추적 모드에서 선의 올바른 위치 지정. 중간: 다음 시점에서 피질과 겹치지 않는 추적 모드에서 선의 잘못된 위치 지정. 오른쪽: 지나치게 넓은 선이 지나면 피질과 선 사이의 교차점(주황색 선)이 직선이 아닙니다. (C)왼쪽: 비추적 모드에서 선의 올바른 위치 지정. 중간: 모든 시점에서 피질과 겹치지 않는 비추적 모드에서 선의 잘못된 위치 지정. 오른쪽: 지나치게 넓은 선이 지나면 피질과 선 사이의 교차점(주황색 선)이 직선이 아닙니다. (D)스캔 라인의 길이와 폭. (E)Linescans은 “회전 단계” 매개 변수에 의해 정의된 간격으로”회전 범위” 매개 변수에 의해 정의된(D)에도시된 원래 오리엔테이션 주위의 방향 범위 내에서 수행됩니다. (F)피질에 비해 스캐닝 라인의 비최적 방향, 라인을 따라 측정된 낮은 신호의 결과. (G)선의 최적 방향은 선을 따라 측정된 신호 강도의 가장 높은 피크를 초래하는 것으로 정의된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.