ショウジョウバエ幼虫における機械的な結知を測定するための改善されたアッセイとツール

1. 機械式プローブ構造 各ニチノールフィラメント(図1B)を、その長い軸に垂直に、小さなワイヤーカッターを使用して指定された長さに切り取ります(図1M–N)。フィラメントには、3つの異なる事前設定直径があります(図1B)。注: ここで指定した長さは、マウントの構築に同様のプロトコルを使用して、示された近似圧力を達成するためのガイドです。最終的には、フィラメントカットの長さ、およびマウント内の穴の深さに関係なく、フィラメントを測定/キャリブレーションして正確な力/圧力値を得る必要があります。 体型顕微鏡でフィラメントの先端を調べて、幼虫の皮膚に組織損傷を与え、校正を妨げる可能性があるため、鋭利または不規則なエッジが残らないようにします。 シャープな凹凸が残らなくなるまで、シャープな砥石を使用して、機械プローブの鋭いエッジを手動で滑らかにします(図1D)。 皮下注射針を使用して木製のポプシクルスティックの端に向かって穴を開けます (図 1E) ( 材料表を参照)。針をポプシクルスティックの高さの少なくとも途中まで挿入します(図1E)。これはニチノールフィラメントの挿入のためのチャンバを作成する。 木の接着剤を単一のニチノールフィラメント(図1F)に塗布し、木製のポプシクルスティックの針スロットに接着剤でコーティングされたフィラメントを挿入します(図1G)。~5時間乾燥させます。 各機械プローブをスケールに押し付けて、機械プローブが曲がるまでキャリブレーションします(図1H–L)。これはグラムで記録することができる最大力のポイントです。フィラメントの直径(事前設定)と長さ(ユーザーが決定)に応じて、全範囲の力と圧力を発生させることができます。 f = ma (力は重力加速度で質量を掛けたものに等しい) を使用して、ステップ 1.6 で記録された質量をミリニュートン (mN) に強制的に変換します。f: 力;m: 質量;a: 重力加速度 (9.8 m/s2) (図 1M) 最後に、測定力をフィラメント先端の表面積で割って算出力を圧力(力/面積)に変換します(図1M)。面積を計算するには、異なるニチノールフィラメントの直径をインチ(0.04″、0.06″、0.08″)からセンチメートルに変換します。そして、πr2( ここで、r=ニチノールフィラメント半径)が面積を決定する( 図1Mを参照)。異なる直径と長さのフィラメントを使用して複数のプローブを準備すると、 ショウジョウバエ 幼虫の応答範囲にまたがるフルセットが生成されます( 図1Nに示すサンプルセット)。注:少なくとも3~4週間ごとに各メカニカルプローブをチェックしてください。圧力が元の尺度から3%以上±ずれた場合、新しい機械式プローブを製造する必要があります。 2. 幼虫の準備 25°Cインキュベーターで標準食品に対する対照株(w1118)ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFPを含む幼虫または幼虫を上昇させる。 通常、在庫は18°Cで日常的に維持されていますが、両親と幼虫の子孫の両方が実験のために標準的なコーンミール食品で25°Cで飼育されています。注:大人のハエ(雄5匹とメス10匹、比率1:2)はハエバイアルに入れておき、産卵を可能にするため、約24時間保たれます。産卵後の時間(AEL)は、大人が取り除かれる時から始まります。 3番目のインスター幼虫を集め、約96時間の産卵後、幼虫を含む柔らかいフライ食品に水道水をそっと噴出して集める。食べ物を残した、または前または後の尖塔を持ち去った放浪幼虫は、このアッセイには大きすぎる/古い。第2のインスター幼虫(長さが4mm未満)が小さすぎる。 ソフトフライ食品の内容物をきれいな標準サイズのペトリ皿(100mm x 15 mm)に注ぎます。 鉗子を使用して、3番目の中星、中型の幼虫( 図2Aを参照)を小さい(第2のインスターおよび初期の第3のインスター)または大きい(後期またはさまよっている第3のインスター)幼虫から分類する。幼虫への組織損傷を避けるために鉗子による穏やかな操作が推奨されます。注:鉗子を使用して移動は、主に水張力に基づいており、鉗子のブレードで幼虫に圧力をかけることではありません。幼虫を操縦するための鉗子の使用に代わるものは柔らかいペンキのブラシである。どちらのツールを使用すると、ユーザーは行動測定を複雑にする可能性のある意図しない組織損傷を引き起こしないように、動物を転送する練習をする必要があります。 鉗子を使用して、3番目の中身の幼虫を、室温で水で湿らせたフライフードの小さなプラグを含む小さなペトリ皿(30mm x 15 mm)に移します。実験が行われるまで小さなペトリ皿に幼虫を入れておいてくださいが、20分以下です。注:一般的に、20~30本の幼虫をフードプラグに移すと、20分間の行動アッセイに十分な数が与えられます。 3. 機械的なノシセプションアッセイ 明るいフィールドの実体顕微鏡の下で黒または暗いビニールの薄いパッドの上に中3分の1のインスター幼虫(鉗子を使用して)を置きます。暗い色は幼虫の視覚化を改善するコントラストを提供する。それはユーザーが触れたり、傷つけることなく幼虫を整列することができるので、暗いビニールの自由に移動可能な部分を持っている方が好ましいです。 顕微鏡対物レンズと黒または暗いビニールパッドの間に光ファイバーライトを入れてください。これにより、幼虫を見るための十分なハイコントラスト照明が可能になります。 パッドへの転写後、正常な移動を示さない幼虫を捨てます。これらは、正常な不可解な行動応答を妨げる可能性があります。通常の移動については、ビデオ 1を参照してください。 洗い流し、ペーパータオルを使用して、幼虫を取り巻く余分な水が幼虫パッドに浮かぶ可能性があります。 暗いビニールパッドを動かして幼虫の向きを変えます。右利きの場合は幼虫の頭/口を左を指し、左利きの場合はその逆を指す必要があります(図2A–B)。 選択した機械的プローブ(通常は1~2s)を、ほぼ腹部セグメントA8の幼虫背側( 図2Bを参照)に適用し、プローブが曲がり、以前に測定された圧力量を引き出す(図2C)。プローブが幼虫の後ろ面に押し付け、プローブ接触点で幼虫を下層部のパッドに圧縮することが重要です。注:ニチノールフィラメントの先端と後部キューティクル表皮との接触点では、2,300kPa未満のプローブは、主にキューティクルと下層の組織を貫通することなく曲がります。このようなプローブは幼虫死亡率に影響を及ぼすことはほとんどありません。より高い圧力(>5,000 kPa)でプローブは曲がり、時にはキューティクルと下層組織に浸透します。幼虫の穿刺は幼虫生存を損なう4 であり、観察された場合、これらの幼虫は典型的には行動解析から廃棄される。 各幼虫の行動応答を記録します。陽性の可分化応答(ビデオ2)は、幼虫が3s以内の体の軸に沿って360°の完全なロールを示す場合に示される。他の応答(旋回、高速クロール、およびウィグリングを試みている)は、このアッセイの目的のために否定的であると考えられます。注:下閾値機械的刺激(200 kPa)で刺激された幼虫は、典型的な可分化または圧延応答を引き出さなかった(ビデオ3)。一部の幼虫は、動きの方向の変化などの早送り応答または軽いタッチ応答を示しました。 幼虫を捨て、次の幼虫をアッセイのために準備し、ステップ3.1から3.7を繰り返します。 必要な数の幼虫に達するまでステップ3.1~3.7を繰り返します(各プローブに対して3~6組のn=10匹の幼虫を使用)。注:低圧の機械プローブ(174-462 kPa)を使用する場合、このアッセイは幼虫あたりより多くの時間がかかります。これは、長いフィラメントの先端がより振動し、A8セグメントの中央に幼虫を突き刺すのが難しくなるためです。これらのプローブでは練習が必要です。 4. 神経形態を評価する共焦点顕微鏡 以前にニチノールフィラメントで刺激された幼虫(感覚ニューロンにラベルを付ける 遺伝子型ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP) を、10mLのジエチルエーテルを浸した綿のボールを運ぶ10mLビーカーを含むコプリン瓶の中のエーテル化チャンバーに入れます。幼虫をチャンバーに座らせて~5分間おきます。注:エーサライゼーションのための詳細なプロトコルは、私たちのグループ12によって発表された以前の研究で提供されています。 幼虫をエーテル化チャンバーから小さなペトリ皿にそっと洗いす。 準備準備1顕微鏡スライド、2つの小さなカバーリップ(22 x 22ミリメートル)、および1つの長いカバースリップ(22 x 54 mm)を持っています( 材料表を参照)。 ether:オイル溶液の小さな滴を加える:スライドの両端に、エチルエーテルとハロカーボンオイル溶液の1:5比、 材料表を参照してください。スライドの両端に小さなカバーリップを置いてから、小さな液滴の上に小さなカバーリップを置きます。この配置は幼虫が収まる小さなスペースギャップを作り出す。メモ:小さなカバーリップを顕微鏡スライドに押し付けて、滑りが難くなるまで押します。 顕微鏡スライドの中央にエーテル:オイル溶液を追加し、その後、顕微鏡スライド(小さなカバーリップの間)の中央に、鉗子を使用して、幼虫を置きます。幼虫の後部軸がスライドの短辺と平行であり、背側が上向きであることを確認します。 幼虫の上に置かれた長いカバースリップと2つの小さなカバーリップで幼虫を覆います。注:幼虫がほぼ平らになるまで長いカバースリップを寛大に押してください。 レーザー波長488(GFP)を用いた共焦点顕微鏡( 材料表参照)を用いた幼虫の画像セグメントA8。注:エーテルを介した麻酔が急速に消え(〜5〜10分)、幼虫が目を覚まして移動するため、すぐに幼虫を画像化すると、さらなるイメージングが複雑になります。 1xズームで20x数値開口(NA)0.7ドライ対物レンズ、ステップサイズ1.5μmでZスタック画像を1024 x 1024ピクセルの解像度でキャプチャします。 5. 組織損傷の定量 セクション 4.8 から Z シリーズ スタック イメージを収集して、単一の Z 投影に変換します (異なる焦点面で撮影された複数の画像を単一の合成画像に平坦化)。これは、市販のソフトウェア(例えば、オリンパスFluoview)または同等のオープンソースプラットフォーム、例えば、フィジー/イメージJを使用して実行することができます。 画像解析プログラムフィジー/イメージJを開きます。 メニュー バーの [ ファイル] をクリックし、表示されたウィンドウから [ 開く ] を選択します。 TIFF 形式で保存された、分析する 1 つのイメージ投影法を選択します。 メニュー バーの [編集] をクリックし、表示されるウィンドウから [反転 ] オプションを選択します。 メニューバーの [ イメージ] をクリックし、表示されたウィンドウから [ 調整] を 選択し、最後に [明るさ/コントラスト ] オプションを選択します。 ツールバーからフリー ハンドシェイプ オプションを選択して、ギャップの面積を測定します(存在する場合)。 メニュー バーの [ 分析] をクリックし、[ 測定] オプションを選択します。これにより、ギャップまたは巻きの領域が表示されます。