Visualizzazione della dinamica di diffusione dei nanorodi d'oro sulla membrana cellulare utilizzando la microscopia a campo scuro a nanoparticella singola

La dinamica delle nanoparticelle (NP) sulla membrana è strettamente associata al processo di assorbimento cellulare, che è essenziale per la comprensione delle funzioni cellulari, delle infezioni virali o batteriche e dello sviluppo di sistemi artificiali di somministrazione nanomedicale^1,2. La tecnica di single particle tracking (SPT) è uno strumento robusto per caratterizzare i comportamenti eterogenei dei PNP^3,4. In generale, la membrana cellulare è fluidica, il che significa che i componenti come proteine e lipidi possono muoversi lateralmente nel piano della membrana^{plasmatica 5,6,7}. La complessità spaziotemporale dell’organizzazione e della struttura della membrana può portare all’eterogeneità spaziotemporale dell’interazione tra NP e membrana. Pertanto, la visualizzazione diretta del movimento dei PNP sulla membrana richiede sia un’alta risoluzione spaziale che temporale.

La microscopia a tracciamento di singole particelle che monitora la localizzazione delle singole particelle nelle cellule viventi con una risoluzione spaziale di decine di nanometri e una risoluzione temporale di millisecondi è stata ben sviluppata per studiare la dinamica dei PN o delle molecole di membrana^8,9. Le tecniche di imaging microscopico a base di fluorescenza sono diventate strumenti preziosi per osservare np/molecole^{nell’ambiente delle cellule viventi 9,10,11,12}. Ad esempio, la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale, che immagini strati sottili (~100 nm) del campione all’interfaccia substrato/soluzione con un’alta risoluzione spaziotemporale è stata ampiamente utilizzata negli studi sulla dinamica delle molecole di membrana^13,14. Tuttavia, gli svantaggi intrinseci dei singoli fluorofori, come la bassa intensità e la rapida fotobleaching irreversibile, riducono l’accuratezza e la durata del tracciamento¹³. Pertanto, i PNP plasmonici non fluorescenti, che sostituiscono le sonde fluorescenti, hanno attirato sempre più attenzione negli studi di imaging a lungo termine a causa delle loro caratteristiche ottiche^{uniche 15}. Sulla base dei segnali di dispersione delle sonde NP plasmoniche, diversi tipi di tecnologie di imaging microscopico ottico sono stati utilizzati per studiare il meccanismo dei processi biologici, come la microscopia a campo scuro (DFM)^16,la microscopia a dispersione interferometrica (iSCAT)¹⁷ e la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DICM)¹⁸. Inoltre, la dinamica di movimento e rotazione degli AuR può essere ottenuta utilizzando DFM e DICM^{18,19,20,21,22}. Tipicamente, in un esperimento SPT, il movimento dell’oggetto viene registrato dal microscopio ottico, e quindi analizzato dai metodi di analisi SPT³. Le traiettorie risolte nel tempo e gli angoli orientativi generati dai singoli NP sono normalmente stocastico ed eterogeneo, quindi è necessario presentare abbondanti informazioni dinamiche con vari metodi di analisi.

Qui forniamo un protocollo integrato che monitora la dinamica degli AuNR sulla membrana cellulare utilizzando DFM, estrae la posizione e l’orientamento degli AuNR con ImageJ e MATLAB e caratterizza la diffusione degli AuNR con metodi di analisi SPT. Come dimostrazione, mostriamo qui come utilizzare il protocollo SPT per visualizzare la dinamica degli AuNR non modificati (CTAB-AuNRs, sintetizzati dalla molecola di bromuro di ammonio di cetilotrimetilammonio come agente protettivo) sulla membrana cellulare U87 MG. È stato dimostrato che i CTAB-AuNR possono adsorbire le proteine nell’ambiente biologico, muoversi sulla membrana cellulare e^{quindi inserire le cellule 2,20,22}. La cellula U87 MG è il tumore più comune e maligno del sistema nervoso centrale e i suoi recettori della membrana sono espressi in modo anomalo. I recettori della membrana possono interagire con le proteine sugli AuNR, che influenzano la dinamica degli AuNR. Il nostro protocollo è generalmente applicabile ad altri esperimenti SPT nel campo della biologia.