Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høy gjennomstrømning screening av kjemiske forbindelser for å belyse deres effekter på bakteriell utholdenhet

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61597
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Houston

Summary

I dette metodepapiret presenterer vi en screeningstrategi med høy gjennomstrømning for å identifisere kjemiske forbindelser, for eksempel osmolytter, som har en betydelig innvirkning på bakteriell utholdenhet.

Abstract

Bakterielle persisters er definert som en liten subpopulation av fenotypiske varianter med evnen til å tolerere høye konsentrasjoner av antibiotika. De er et viktig helseproblem da de har vært forbundet med tilbakevendende kroniske infeksjoner. Selv om stokastisk og deterministisk dynamikk i stressrelaterte mekanismer er kjent for å spille en betydelig rolle i utholdenhet, er mekanismer som ligger til grunn for fenotypisk bytte til / fra utholdenhetstilstanden ikke helt forstått. Mens utholdenhetsfaktorer utløst av miljøsignaler (f.eks. uttømming av karbon-, nitrogen- og oksygenkilder) er grundig studert, er virkningene av osmolytter på utholdenhet ennå ikke bestemt. Ved hjelp av mikroarrays (dvs. 96 brønnplater som inneholder ulike kjemikalier), har vi designet en tilnærming for å belyse effekten av ulike osmolytter på Escherichia coli utholdenhet på en høy gjennomstrømning måte. Denne tilnærmingen er transformativ, da den lett kan tilpasses andre screeningmatriser, for eksempel stoffpaneler og genutslagsbiblioteker.

Introduction

Bakteriekulturer inneholder en liten subpopulasjon av utholdenhetsceller som er midlertidig tolerante for uvanlig høye nivåer av antibiotika. Persisterceller er genetisk identiske med deres antibiotikafølsomme huder, og deres overlevelse har blitt tilskrevet forbigående veksthemming1. Persister celler ble først oppdaget av Gladys Hobby2, men begrepet ble først brukt av Joseph Bigger da han identifiserte dem i penicillin-behandlet Staphylococcus pyogenes kulturer3. En seminalstudie publisert av Balaban et al.4 oppdaget to utholdenhetstyper: type I-varianter som hovedsakelig dannes ved passasje gjennom den stasjonære fasen, og type II-varianter som kontinuerlig genereres under den eksponentielle veksten. Persisters oppdages av clonogenic overlevelsesanalyser, der kulturprøver tas med ulike intervaller under antibiotikabehandlinger, vasket og belagt på et typisk vekstmedium for å telle de overlevende cellene som kan kolonisere i fravær av antibiotika. Eksistensen av persisters i en cellekultur vurderes av en bifasisk drapskurve4,5 der det første eksponentielle forfallet indikerer død av antibiotikafølsomme celler. Imidlertid reduseres drapstrenden over tid, noe som til slutt fører til en platåregion som representerer de overlevende utholdenhetscellene.

Persisterceller har vært forbundet med ulike sykdommer som tuberkulose6, cystisk fibrose7, candidiasis8 og urinveisinfeksjoner9. Nesten alle mikroorganismer testet så langt ble funnet å generere persister fenotyper, inkludert svært patogen Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 og Candida albicans8. Nyere studier gir også bevis på økningen av multidrug-resistente mutanter fra persister subpopulations11,12. Betydelig innsats på dette feltet har avdekket at utholdenhetsmekanismer er svært komplekse og mangfoldige; både stokastiske og deterministiske faktorer forbundet med SOS-responsen13,14, reaktive oksygenarter (ROS)15, toksin/antitoksin (TA) systemer16, autofagi eller selvfordøyelse17 og ppGpp-relatert streng respons18 er kjent for å lette utholdenhetsdannelse.

Til tross for betydelig fremgang i å forstå utholdenhet fenotypen, har effekten av osmolytter på bakteriell utholdenhet ikke blitt fullt ut forstått. Siden vedlikehold av optimalt osmotisk trykk er en nødvendighet for cellenes vekst, riktig funksjon og overlevelse, kan en grundig studie av osmolytter føre til potensielle mål for anti-persister strategier. Selv om arbeidskrevende, høy gjennomstrømning screening er en svært effektiv tilnærming for å identifisere metabolitter og andre kjemikalier som spiller en avgjørende rolle i utholdenhet fenotype19,20. I dette arbeidet vil vi diskutere vår publiserte metode19, hvor vi har brukt mikroarrays, det vil si 96 brønnplater som inneholder ulike osmolytter (f.eks. natriumklorid, urea, natriumnitritt, natriumnitrat, kaliumklorid), for å identifisere osmolytter som betydelig påvirker E. coli utholdenhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av vekstmedium, ofloxacinløsning og E. coli-cellelagrer

  1. Vanlig Luria-Bertani (LB) medium: Tilsett 10 g/l trypton, 10 g/l natriumklorid (NaCl) og 5 g/l gjærekstrakt i deionisert (DI) vann. Steriliser mediet ved autoklavering.
  2. LB agarplater: Tilsett 10 g/l trypton, 10 g/l nacl, 5 g/l gjærekstrakt og 15 g/l agar i DI-vann og steriliser mediet ved autoklavering. Ved ønsket temperatur (~55 °C) hell ~30 ml agarmedium i firkantede plater (10 x 10 cm). Tørk platene og oppbevar dem ved 4 °C.
  3. Modifisert LB-medium: Tilsett 10 g/l trypton og 5 g/l gjærekstrakt i DI-vann. Steriliser mediet ved autoklavering.
  4. Modifisert LB-medium inkludert osmolytt: Bland 2x modifisert LB-medium med en 2x osmolyttløsning i like store volumer. For å forberede 2x modifisert LB medium, tilsett 20 g/l trypton og 10 g/l gjærekstrakt i DI-vann og steriliser ved autoklavering. For å forberede 2x osmolyttoppløsningen, oppløs osmolytten av interesse (2x mengde) i DI-vann, og filtrer deretter steriliser løsningen.
    MERK: Interessens osmolytt og konsentrasjoner kan bestemmes ut fra Phenotype Microarray-screeninganalysene (se protokoll 4). Den testede osmolytten og den tilhørende 2x konsentrasjonen kan imidlertid justeres avhengig av forskningens natur. For eksempel, for å studere effekten av 1 mM natriumklorid, vil en 2x osmolyttoppløsning være en 2 mM natriumkloridoppløsning.
  5. Ofloxacin lageroppløsning (5 mg/ml): Tilsett 5 mg ofloxacin (OFX) salt i 1 ml DI-vann. Tilsett 10 μL 10 M natriumhydroksid for å øke oppløseligheten av OFX i vann, og filtrer deretter sterilisering av oppløsningen. Forbered aliquots og lagre ved -20 °C.
    MERK: Ofloxacin er et kinolon antibiotika som har blitt mye brukt til både voksende og ikke-voksende bakterieceller14,21. Minimum hemmende konsentrasjon (MIC) av OFX for E. coli MG1655 celler er innenfor området 0,039-0,078 μg/ml19,20. Vær også oppmerksom på at andre antibiotika som ampicillin og kanamycin ofte brukes i vedvarende forskning. Valget av antibiotika er avhengig av studiens natur.
  6. E. coli MG1655 cellelagre: Inokuler 2 ml vanlig LB-medium med en enkelt koloni i et 14 ml reagensrør (snap-capped) og kultur cellene i en orbital shaker ved 250 rpm og 37 °C. Når cellene når den stasjonære fasen, bland 500 μL av cellekulturen med 500 μL 50% glyserol (steril) i et kryogent hetteglass og lagre ved -80 °C.

2. Forplantning av celler for å eliminere eksisterende utholdenhet

  1. For å forberede en nattkultur, skrap en liten mengde celler fra en frossen cellebestand med en steril pipettespiss (ikke tine glyserolcellebestanden), og inokuler cellene i 2 ml modifisert LB-medium i et 14 ml snap-capped reagensrør. Kultur cellene i en orbital shaker ved 250 rpm og 37 °C i 12 timer.
  2. Første overføring
    1. Etter 12 timer, overfør 250 μL over natten kultur til 25 ml fersk modifisert LB medium i en 250 ml forbløffet kolbe dekket med en steril aluminiumsfolie.
    2. Utvid cellekulturen i en orbital shaker ved 250 o/min og 37 °C til cellene når midteksponentiell fase (OD600 = 0,5).
    3. Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) ved hjelp av en mikroplateleser hvert 30.
  3. Andre overføring
    1. Ved OD600 = 0,5, fortynn 250 μL cellekultur fra den første kolben til 25 ml ferskt modifisert LB-medium i en 250 ml forbløffet kolbe.
    2. Vokse den andre cellekulturen i en orbital shaker ved 250 rpm og 37 °C til OD600=0,5.
    3. Mål den optiske tettheten hvert 30.
      MERK: En nattkultur kan ha en betydelig mengde utholdenhetsceller4,5,22. Fortynnings-/vekstsyklusmetoden5 beskrevet ovenfor kan brukes til å eliminere disse eksisterende utholdenhetene før du overfører cellene til mikroarrayer. Deres eliminering kan valideres ved å kvantifisere vedvarende nivåer av nattkulturer med analysen beskrevet i protokoll 3. Denne metoden er allerede validert i en tidligere studie19.

3. Validering av eliminering av eksisterende utholdenhetsceller

  1. Etter den andre forplantningen (se trinn 2.3), fortynn 250 μL av cellekulturen (OD600 = 0,5) i 25 ml fersk modifisert LB-medium i en 250 ml forbløffet kolbe.
    MERK: For kontroller, fortynn 250 μL over natten kultur (se trinn 2.1) i 25 ml fersk modifisert LB medium i en 250 ml forbløffet kolbe. Før du overfører cellene til kolben, bør celletettheten til nattkulturen justeres i ferskt modifisert LB-medium for å oppnå OD600 = 0,5.
  2. Tilsett 25 μL OFX lageroppløsning (5 mg/ml) i cellefjæringen og rist kolben forsiktig for å gjøre analysekulturen homogen. Den endelige konsentrasjonen av OFX er 5 μg/ml i analysekulturen.
  3. Inkuber analysekulturen i en orbital shaker ved 250 o/min og 37 °C.
  4. Hver time under behandlingen (inkludert 0 t, tidspunktet før du legger OFX inn i analysekulturen), overfør 1 ml av analysekulturen fra kolben til et 1,5 ml mikrosenterrør.
  5. Sentrifuger analysekulturen i mikrosentrifugerøret på 17 000 x g i 3 min.
  6. Fjern forsiktig 950 μL av supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
  7. Tilsett 950 μL fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) i mikrocentrifugerøret.
  8. Gjenta vasketrinnene 3,5-3,7 for 3x totalt til antibiotikakonsentrasjonen er under minimum hemmende konsentrasjon (MIC).
  9. Etter den endelige vasken, resuspend cellepellet i 100 μL PBS-løsning, noe som resulterer i en 10x konsentrert prøve.
  10. Ta 10 μL av celleopphenget og fortynn seks ganger i 90 μL PBS-oppløsning ved hjelp av en 96 brønn rund bunnplate.
  11. Spot 10 μL fortynnet celle suspensjoner på antibiotikafrie friske agarplater. For å øke deteksjonsgrensen, skriv de resterende 90 μL cellefjæring på en fersk agarplate.
  12. Inkuber agarplatene ved 37 °C i 16 timer, og tell deretter kolonidannende enheter (CFUer). Gjøre rede for fortynningshastighetene ved beregning av totalt antall CFUer i 1 ml analysekultur. Kill kurver genereres ved å plotte logaritmiske CFU-verdier med hensyn til varigheten av antibiotikabehandling.
    MERK: En 6 timers OFX-behandling er tilstrekkelig til å oppnå en bifasisk drapskurve for E. coli-celler 19,20. Det vedvarende nivået av forplantede celler (målt ved CFU teller ved 6 timer) bør være betydelig mindre enn for nattkulturen. Prosedyrene beskrevet i protokoll 2 og 3 kan utføres med vanlig LB avhengig av forskningsdesignet.

4. Mikroarray plate screenings

  1. Forbereder mikroarray-cellekulturer
    1. Overfør 250 μL eksponentielle faseceller til 25 ml ferskt modifisert LB-medium i et 50 ml sentrifugerør. Bland forsiktig cellefjæringen for å gjøre den homogen.
      MERK: Eksponentiellfasecellene (OD600 = 0,5) er hentet fra det andre forplantningstrinnet (se trinn 2.3).
    2. Overfør den fortynnede cellefjæringen til et sterilt 50 ml reservoar.
    3. Bruk en flerkanals pipette, overfør 150 μL av cellefjæringen til hver brønn av en mikroarray, det vil si en 96 brønnplate som inneholder forskjellige osmolytter.
      MERK: Brønner som ikke har osmolytter fungerer som kontroller.
    4. Dekk mikroarrayen med en gassgjennomtrengelig tetningsmembran.
    5. Inkuber platen i en orbital shaker ved 37 °C og 250 o/min i 24 timer.
      MERK: I disse eksperimentene ble det brukt kommersielt tilgjengelige plater, for eksempel Fenotype Microarrays (PM-9 og PM-10) som inkluderer et bredt spekter av osmolytter, pH-buffere og andre kjemikalier i tørket tilstand ved ulike konsentrasjoner. Disse mikroarrayene er i halv-område 96 brønnplateformater. Kulturvolumene bør justeres avhengig av hvilken type plater som brukes. Mikroarrays kan også genereres manuelt (se nedenfor).
  2. Manuell tilberedning av mikroarrayplater
    1. Overfør 75 μL 2x osmolyttløsninger til brønnene på en halv areal 96 brønnplate.
    2. Overfør 500 μL eksponentielle faseceller til 25 ml 2x modifisert LB-medium i et 50 ml sentrifugerør. Bland forsiktig cellefjæringen for å gjøre den homogen.
      MERK: Inokuleringshastigheten ble justert slik at den samsvarer med mikroarrayscreeningsprotokollen som er beskrevet i 4.1.
    3. Tilsett 75 μL av cellefjæringen i hver brønn på halvarealet 96 brønnplate som inneholder 2x osmolyttløsninger.
    4. Inkuber platen i en orbital shaker ved 37 °C og 250 o/min i 24 timer.
  3. Forbereder vedvarende analyseplater
    1. Forbered 25 ml modifisert LB-medium som inneholder 5 μg/ml OFX i et 50 ml sentrifugerør og overfør dette mediet til et sterilt reservoar.
    2. Overfør 190 μL modifisert LB-medium med OFX fra reservoaret til hver brønn av en generisk flatbunns 96 brønnplate (persister-assay plate) ved hjelp av en flerkanals pipette.
    3. Fjern mikroarrayen fra shakeren (etter dyrking i 24 timer) og overfør 10 μL cellekulturer fra mikroarrayen til brønnene til den vedvarende analyseplaten, som inneholder modifisert LB-medium med OFX.
    4. Ta 10 μL cellesuspensjoner fra persister-analyseplaten og fortynn serielt tre ganger i 290 μL PBS-oppløsning ved hjelp av en rundbunns 96 brønnplate og en flerkanals pipette.
    5. Etter seriell fortynning, spot 10 μL av alle serie fortynnede celle suspensjoner på antibiotikafrie friske agarplater ved hjelp av en flerkanals pipette.
    6. Inkuber den vedvarende analyseplaten (fremstilt i trinn 4.3.3) i en orbital shaker ved 37 °C og 250 o/min i 6 timer etter å ha dekket platen med en gassgjennomtrengelig tetningsmembran.
    7. Etter 6 timers inkubasjon i en shaker, ta ut persister-analyseplaten og gjenta trinnene 4.3.4-4.3.5.
    8. Inkuber agarplatene i 16 timer ved 37 °C, og tell deretter CFUer. CFU-nivåene før og 6 timer etter antibiotikabehandlingen gjør det mulig å beregne den vedvarende fraksjonen i hver brønn. CFU teller før OFX-behandlingen også bidra til å vurdere effekten av osmolytter og på E. coli levedyktighet.

5. Validere de identifiserte betingelsene

  1. Overfør 250 μL av de eksponentielle fasecellene fra trinn 2,3 til 25 ml ferskt modifisert LB-medium som inneholder osmolytten identifisert fra mikroarrayscreeningen (se protokoll 4).
  2. Inkuber kolben i en orbital shaker ved 250 rpm og 37 °C i 24 timer.
  3. Etter 24 timer, fjern kolben fra shakeren og overfør 250 μL av cellekulturen til 25 ml fersk modifisert LB-medium i en 250 ml forbløffet kolbe.
  4. Tilsett 25 μL OFX lageroppløsning (5 mg/ml) i cellefjæringen og rist kolben forsiktig for å gjøre analysekulturen homogen. Inkuber kolben i en shaker ved 37 °C og 250 o/min.
  5. Ved hver time under behandlingen overfører du 1 ml av analysekulturen fra kolben til et 1,5 ml mikrosenterrør.
  6. Sentrifuger analysekulturen i mikrosentrifugerøret på 17 000 x g i 3 min.
  7. Fjern 950 μL supernatant og tilsett 950 μL PBS.
  8. Gjenta vasketrinnene 5,6 og 5,7 for 3x.
  9. Etter den endelige vasken, resuspend cellepellet i 100 μL AV PBS-løsning.
  10. Ta 10 μL av celleopphenget og fortynn 6x i 90 μL PBS-oppløsning ved hjelp av en 96 brønn rund bunnplate.
  11. Spot 10 μL av de fortynnede cellesuspensjonene på en antibiotikafri fersk agarplate. For å øke deteksjonsgrensen, skriv de resterende 90 μL cellefjæring på en fersk agarplate.
  12. Inkuber agarplaten ved 37 °C i 16 timer, og tell deretter CFUer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 beskriver vår eksperimentelle protokoll. Fortynnings-/vekstsykluseksperimentene (se protokoll 2) ble tilpasset fra en studie utført av Keren et al.5 for å eliminere utholdenhetene som stammer fra nattkulturene. Figur 2A er et representativt bilde av agarplater som brukes til å bestemme CFU-nivåer av cellekulturer før og etter OFX-behandling. I disse eksperimentene ble celler dyrket i modifisert LB-medium med osmolytter i halvareal 96 brønnplater som beskrevet i trinn 4.2. Etter å ha inkubert platen i en orbital shaker i 24 timer, ble den vedvarende analysen utført ved hjelp av en generisk flat bunn 96 brønnplate (se trinn 4.3). Osmolyttene og konsentrasjonen som testes her ble valgt basert på vår forrige studie19, hvor vi utførte trinn 4.1 og 4.3 ved hjelp av PM-9-platen som inkluderer ulike osmolytter ved forskjellige konsentrasjoner (natriumklorid, kaliumklorid, natriumsulfat, etylenglykol, natriumformat, urea, natriumlaktat, natriumfosfat, natriumbenzoat, ammoniumsulfat, natriumnitritt og natriumnitrat). Den første kolonnen i figur 2A viser CFU-tellingene for kontrollgruppen. Den andre kolonnen representerer en tilstand der celler ble dyrket i 100 mM natriumnitrat; denne tilstanden ble tidligere funnet å øke de vedvarende nivåene19litt . Den tredje kolonnen representerer en tilstand der celler ble dyrket i 60 mM natriumnitritt, og denne tilstanden ble tidligere funnet å redusere de vedvarende nivåene betydelig sammenlignet med kontroller19. Figur 2B er en grafisk fremstilling av CFU-dataene hentet fra agarplatene. Figur 2C viser de vedvarende fraksjonene av cellekulturene som er testet i 96 brønnplater. For å beregne fraksjonene ble vedvarende tellinger normalisert til celletallene oppnådd før antibiotikabehandlingene. Figur 3 viser henholdsvis de bifasiske drapskurvene og de vedvarende fraksjonene for analysekulturene som utføres i forvirrede kolber. I disse eksperimentene ble cellene først dyrket i 25 ml modifisert LB-medium med de angitte osmolyttene i 250 ml forvirrede kolber i 24 timer, og deretter ble cellene overført til persister-assay kolber for vedvarende opplisting som beskrevet i protokoll 5.

Figure 1
Figur 1: Den eksperimentelle prosedyren. Celler fra en frossen cellebestand ble dyrket over natten (12 timer) i ferskt LB-medium. Ved 12 timer ble nattkulturen fortynnet (1:100) i 25 ml modifisert LB medium og vokst til OD600=0,5. Dette overføringstrinnet ble gjentatt to ganger. Etter det siste forplantningstrinnet ble de eksponentielle fasecellene (ved OD600=0,5) fortynnet (1:100) i ferskt modifisert LB-medium i henholdsvis en 250 ml forbløffet kolbe og et 50 ml sentrifugerør. Cellesuspensjonen i den 250 ml forbløffede kolben ble behandlet med 5 μg/ml OFX for å kvantifisere vedvarere. Cellefjæringen i 50 ml sentrifugerøret ble overført til mikroarrayer og inkubert i 24 timer i en orbital shaker ved 250 rpm og 37 °C. Cellene fra mikroarrayene ble deretter overført til persister-analyseplater for å kvantifisere persisters. Dette tallet ble opprettet ved hjelp av biorender.com. Dette tallet er endret fra vår forrige publikasjon19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mikroarrayeksperimenter. (A) Celler ble først dyrket i modifisert LB medium med eller uten angitte osmolytter i et halvt område 96 brønnplate i 24 timer. Cellene ble deretter overført til en generisk flatbunns 96 brønnplate og behandlet med 5 μg/ml OFX i 6 timer. Før og etter 6 timers behandling ble cellene serielt fortynnet i PBS, belagt på agarplater og inkubert ved 37 °C i 16 timer. Hver betingelse har 8 tekniske repliker. (B) CFU-målinger ble utført for å vurdere effekten av osmolytter på henholdsvis celle levedyktighet og utholdenhet. Den rette linjen angir grensen for deteksjon (600 CFUer). (C) Grafen representerer de vedvarende brøkdelene av cellekulturene, beregnet ved å ta forholdet mellom CFU-tellingene etter og før OFX-behandling. Den vedvarende brøkdelen av cellekulturen som har 60 mM natriumnitritt ble ikke beregnet da det vedvarende nivået er under deteksjonsgrensen. Hvert datapunkt ble betegnet med gjennomsnittsverdi ± standardavvik, beregnet fra 8 tekniske replikeringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Valideringseksperimenter. (A) Eksponentielle faseceller ble overført til 25 ml fersk modifisert LB-medium med indikerte osmolytter i 250 ml forvirrede kolber og dyrket i 24 timer. Deretter ble cellene fortynnet (1:100) i 250 ml forbløffede kolber som inneholder 25 ml modifisert LB-medium og behandlet med 5 μg/ml OFX i 6 timer. CFU-tellingene i analysekulturene ble overvåket hver time for å generere bifasiske drapskurver. * indikerer tilstanden som påvirker OFX-utholdenhetsnivåene betydelig sammenlignet med ikke-osmolyttkontroller (tosidige ulik varians t-test, p<0,05). (B) Grafen representerer de faste brøkdelene av kulturene. Hvert datapunkt ble betegnet med gjennomsnittsverdi ± standardavvik, beregnet fra 3 biologiske replikeringer. Dette tallet er endret fra vår forrige publikasjon19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den høye gjennomstrømningen vedvarer analysen beskrevet her ble utviklet for å belyse effekten av ulike kjemikalier på E. coli utholdenhet. I tillegg til kommersielle PM-plater kan mikroarrayer konstrueres manuelt som beskrevet i trinn 4.2. Dessuten er protokollen som presenteres her fleksibel og kan brukes til å screene andre mikroarrays, for eksempel narkotikapaneler og cellebiblioteker, som er i 96 brønnplateformater. De eksperimentelle forholdene, inkludert vekstfasen, inokulasjonsraten og mediet, kan justeres for å teste disse bibliotekene. For eksempel, hvis man ønsker å screene et cellebibliotek, for eksempel Keio E. coli knockout collection23, kan de først overføre stammene fra biblioteket til 96 brønnplater som inkluderer friske medier, ved hjelp av en flerkanals pipette. Når cellene når ønsket vekstfase (f.eksponentiell eller stasjonær fase), overføres cellene deretter til vedvarende analyseplater som beskrevet i trinn 4.3 for å liste opp de vedvarende nivåene av knockout-stammene. På samme måte kan denne strategien brukes til å screene E. coli Promoter-samlingen 24 (et bibliotek med fluorescerende reporterstammer i 96 brønnplateformater) for å identifisere promotører som aktiveres av antibiotika. Disse promotorene kan lett oppdages ved å måle fluorescenssignalene til stammer i vedvarende analyseplater under antibiotikabehandlingen.

I våre eksperimenter brukte vi en modifisert LB (mangler NaCl) for å unngå ytterligere effekt som kan oppstå fra NaCl, med tanke på at mikroarrayene allerede har forskjellige osmolytter. Selv om NaCl i vanlig LB-medium er kjent for å være bra for å bevare membranintegriteten til celler, har det blitt rapportert at NaCl ved 0-1% område har en minimal effekt på cellevekst25. Videre har resultater fra propidiumjodid (PI) farging og vedvarende analyser i vår forrige studie vist at fraværet av NaCl ikke påvirker membranintegriteten og utholdenheten til E. coli-celler 19betydelig . Denne modifikasjonen ble gjort spesielt for å adressere bekymringene i studien vår og kan endres basert på forskningens art.

Vi har også tilpasset en metode utviklet av Keren et al.5 for å eliminere eksisterende utholdenhet i cellekulturene våre før inokulering i mikroarrayene. Type I-vedvarer er kjent for å genereres i den stasjonære fasen. Derfor vil direkte inokulering av cellene fra nattkulturer til mikroarrayplater overføre et betydelig antall utholdenheter, noe som kan hindre effekten av osmolytter. Med fortynnings-/vekstsykluseksperimentene (se protokoll 2) kunne vi redusere disse eksisterende utholdenhetene som følge av nattkulturene19betydelig . Vi merker at vi har dyrket cellene i mikroarrayplater i 24 timer for å kunne telle alle persisters, inkludert type I-varianter som dannes under den stasjonære fasen i nærvær av osmolytter. Imidlertid kan disse tilpassede teknikkene alltid endres avhengig av studiens natur.

Vi behandlet cellene i mikroarrays med 5 μg/ml OFX for å liste opp utholdenhetene. Siden vaskeprosedyren for å fjerne antibiotika fra 96 prøver ville være svært arbeidskrevende, ble celler etter behandlingen serielt fortynnet i PBS uten vask (se trinn 4.2). Denne prosedyren fortynnet OFX-konsentrasjonen mer enn 30 ganger. De fortynnede cellefjæringene ble deretter belagt på antibiotikafrie agarplater der OFX ble ytterligere spredt. Våre foreløpige studier der vi gjentok disse eksperimentene med og uten vask, har bekreftet at denne serielle fortynningsmetoden ikke påvirket de vedvarende nivåene19.

Under flerkanals pipettering i 96 brønnplater bør man nøye blande cellesuspensjonene for å opprettholde en homogen cellefordeling. For å gjøre dette, avhengig av arbeidsvolumet, vil det være gunstig å merke seg det minste antall pipettering som trengs for å gjøre løsningen homogen. Til dette formål gjennomførte vi et enkelt kontrolleksperiment der vi overvåket pipetteringen (opp og ned) ved å spre et fargemolekyl i PBS og medium under forholdene som ble studert her. I tillegg, hvis du arbeider med mer komplekse miljøer som pH-buffere, vil vi foreslå å måle pH i cellekulturen før og under inkubasjonen i en shaker, da cellekulturen har en tendens til å være svært alkalisk (pH ≈ 8) over tid. Dette kan gi en ide om kvaliteten så vel som pH-serien til bufferen som brukes. I tillegg, for å oppnå tellbare CFUer på agarplater fra høygjennomstrømningsanalysene, bør visse forhold, for eksempel celleinokuleringshastigheten, kulturalderen og serielle fortynningsparametere (PBS-volum, fortynningshastigheter og antall fortynningstrinn, etc.) optimaliseres før du tester mikroarrayene. Til slutt bør resultatene fra mikroarrayene valideres ytterligere i kolber, da volumet av kultur, overflateareal og lufting i en 96 brønnplate kan ha ytterligere effekter på de observerte resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil takke medlemmene av Orman Lab for deres verdifulle innspill i løpet av denne studien. Denne studien ble finansiert av NIH/NIAID K22AI125468 karriereovergangspris og et oppstartsstipend fra University of Houston.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14-ml test tube Fisher Scientific 14-959-1B
E. coli strain MG1655 Princeton University Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-5161
Gas permeable sealing membrane VWR 102097-058 Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate VWR 82050-062
LB agar Fisher Scientific BP1425-2 Molecular genetics grade
Ofloxacin salt VWR 103466-232 HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) Biolog N/A PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-0161
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500 Certified ACS grade
Sodium nitrate Fisher Scientific AC424345000 ACS reagent grade
Sodium nitrite Fisher Scientific AAA186680B 98% purity
Square petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Tryptone Fisher Scientific BP1421-500 Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader Thermo Fisher Scientific VLBL00D0 Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-100 Molecular genetics grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).
  2. Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).
  3. Bigger, J. Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation. The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).
  4. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  5. Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).
  6. Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters. mBio. 2 (3), (2011).
  7. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis. Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  8. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  9. Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides. Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).
  10. Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).
  11. Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic. Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).
  12. Windels, E. M., et al. Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates. ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).
  13. Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli. PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).
  14. Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery. mBio. 6 (5), (2015).
  15. Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).
  16. Gerdes, K., Maisonneuve, E. Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).
  17. Orman, M. A., Brynildsen, M. P. Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli. Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).
  18. Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis. Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).
  19. Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).
  20. Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence. Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).
  21. Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).
  22. Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).
  23. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).
  24. Zaslaver, A., et al. A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli. Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).
  25. Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy. Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).

Tags

Tilbaketrekning utgave 168 persisters screening med høy gjennomstrømning fenotype mikroarrays pH osmolytter antibiotika
Høy gjennomstrømning screening av kjemiske forbindelser for å belyse deres effekter på bakteriell utholdenhet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karki, P., Orman, M. A.… More

Karki, P., Orman, M. A. High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence. J. Vis. Exp. (168), e61597, doi:10.3791/61597 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter