Summary
In diesem Methodenpapier stellen wir eine Hochdurchsatz-Screening-Strategie vor, um chemische Verbindungen wie Osmolyte zu identifizieren, die einen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Persistenz haben.
Abstract
Bakterielle Persister sind definiert als eine kleine Subpopulation phänotypischer Varianten mit der Fähigkeit, hohe Konzentrationen von Antibiotika zu vertünden. Sie sind ein wichtiges Gesundheitsproblem, da sie mit wiederkehrenden chronischen Infektionen in Verbindung gebracht wurden. Obwohl bekannt ist, dass stochastische und deterministische Dynamiken stressbezogener Mechanismen eine bedeutende Rolle bei der Persistenz spielen, sind die Mechanismen, die dem phänotypischen Wechsel zum/vom Persistenzzustand zugrunde liegen, nicht vollständig verstanden. Während Persistenzfaktoren, die durch Umweltsignale ausgelöst werden (z. B. Erschöpfung von Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffquellen), umfassend untersucht wurden, müssen die Auswirkungen von Osmolyten auf die Persistenz noch bestimmt werden. Mit Microarrays (d.h. 96 Brunnenplatten, die verschiedene Chemikalien enthalten) haben wir einen Ansatz entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Osmolyte auf die Persistenz von Escherichia coli mit hohem Durchsatz aufzuklären. Dieser Ansatz ist transformativ, da er leicht für andere Screening-Arrays wie Arzneimittelpanels und Gen-Knockout-Bibliotheken angepasst werden kann.
Introduction
Bakterienkulturen enthalten eine kleine Subpopulation von Persisterzellen, die vorübergehend tolerant gegenüber ungewöhnlich hohen Antibiotikaspiegeln sind. Persisterzellen sind genetisch identisch mit ihren antibiotikaempfindlichen Verwandten, und ihr Überleben wurde der vorübergehenden Wachstumshemmung zugeschrieben1. Persisterzellen wurden zuerst von Gladys Hobby2 entdeckt, aber der Begriff wurde zuerst von Joseph Bigger verwendet, als er sie in Penicillin-behandelten Staphylococcus pyogenes-Kulturen identifizierte3. Eine bahnbrechende Studie, die von Balaban et al.4 veröffentlicht wurde, entdeckte zwei Persistertypen: Typ-I-Varianten, die hauptsächlich durch die Passage durch die stationäre Phase gebildet werden, und Typ-II-Varianten, die während des exponentiellen Wachstums kontinuierlich erzeugt werden. Persister werden durch klonogene Überlebenstests nachgewiesen, bei denen Während der Antibiotikabehandlung in verschiedenen Abständen Kulturproben entnommen, gewaschen und auf einem typischen Wachstumsmedium plattiert werden, um die überlebenden Zellen zu zählen, die sich ohne Antibiotika ansiedeln können. Die Existenz von Persistern in einer Zellkultur wird durch eine biphasische Tötungskurve4,5 beurteilt,wobei der anfängliche exponentielle Zerfall den Tod antibiotikaempfindlicher Zellen anzeigt. Der Tötungstrend nimmt jedoch im Laufe der Zeit ab, was schließlich zu einer Plateauregion führt, die die überlebenden Persisterzellen darstellt.
Persisterzellen wurden mit verschiedenen Krankheiten wie Tuberkulose6, Mukoviszidose7, Candidiasis8 und Harnwegsinfektionen9 inVerbindung gebracht . Fast alle bisher getesteten Mikroorganismen erzeugen persistere Phänotypen, darunter hochpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 und Candida albicans8. Neuere Studien liefern auch Hinweise auf den Anstieg multiresistenter Mutanten aus persisteren Subpopulationen11,12. Erhebliche Anstrengungen in diesem Bereich haben gezeigt, dass Persistenzmechanismen sehr komplex und vielfältig sind; Es istbekannt,dass sowohl stochastische als auch deterministische Faktoren, die mit der SOS-Reaktion13,14, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)15, Toxin/Antitoxin (TA) -Systemen16, Autophagie oder Selbstverdauung17 und ppGpp-bezogener strenger Reaktion18 verbunden sind, die Persisterbildung erleichtern.
Trotz signifikanter Fortschritte beim Verständnis des Persistenzphänotyps sind die Auswirkungen von Osmolyten auf die bakterielle Persistenz nicht vollständig verstanden. Da die Aufrechterhaltung eines optimalen osmotischen Drucks eine Notwendigkeit für das Wachstum, die ordnungsgemäße Funktion und das Überleben der Zellen ist, könnte eine eingehende Untersuchung von Osmolyten zu potenziellen Zielen für Anti-Persister-Strategien führen. Obwohl mühsam, ist das Hochdurchsatz-Screening ein sehr effektiver Ansatz zur Identifizierung von Metaboliten und anderen Chemikalien, die eine entscheidende Rolle bei der Persistenz des Phänotyps19,20spielen. In dieser Arbeit werden wir unsere veröffentlichte Methode19diskutieren, bei der wir Microarrays verwendet haben, dh 96 Wellplatten, die verschiedene Osmolyte enthalten (z. B. Natriumchlorid, Harnstoff, Natriumnitrit, Natriumnitrat, Kaliumchlorid), um Osmolyte zu identifizieren, die die Persistenz von E. coli signifikant beeinflussen.
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Protocol
1. Herstellung von Wachstumsmedium, Ofloxacinlösung und E. coli-Zellbeständen
- Normales Luria-Bertani (LB) Medium: Fügen Sie 10 g / L Trypton, 10 g / L Natriumchlorid (NaCl) und 5 g / L Hefeextrakt in entionisiertem (DI) Wasser hinzu. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren.
- LB-Agarplatten: Fügen Sie 10 g / L Trypton, 10 g / L NaCl, 5 g / L Hefeextrakt und 15 g / L Agar in DI-Wasser hinzu und sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren. Bei der gewünschten Temperatur (~55 °C) ~30 mL Agarmedium in quadratische Platten (10 x 10 cm) gießen. Die Platten trocknen und bei 4 °C lagern.
- Modifiziertes LB-Medium: Fügen Sie 10 g / L Trypton und 5 g / L Hefeextrakt in DI-Wasser hinzu. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren.
- Modifiziertes LB-Medium einschließlich Osmolyt: Mischen Sie 2x modifiziertes LB-Medium mit einer 2x Osmolytlösung in gleichen Mengen. Um 2x modifiziertes LB-Medium vorzubereiten, fügen Sie 20 g / L Trypton und 10 g / L Hefeextrakt in DI-Wasser hinzu und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren. Um die 2x Osmolytlösung vorzubereiten, lösen Sie den interessierende Osmolyten (2x Menge) in DI-Wasser auf und sterilisieren Sie dann die Lösung.
HINWEIS: Der interessierenswerte Osmolyt und seine Konzentrationen können aus den Phänotyp-Microarray-Screening-Assays bestimmt werden (siehe Protokoll 4). Der getestete Osmolyt und die damit verbundene 2-fache Konzentration können jedoch je nach Art der Forschung angepasst werden. Um beispielsweise die Auswirkungen von 1 mM Natriumchlorid zu untersuchen, wäre eine 2x Osmolytlösung eine 2 mM Natriumchloridlösung. - Ofloxacin-Stammlösung (5 mg/ml): 5 mg Ofloxacin (OFX)-Salz in 1 ml DI-Wasser hinzufügen. Fügen Sie 10 μL 10 M Natriumhydroxid hinzu, um die Löslichkeit von OFX in Wasser zu erhöhen, und filtern Sie dann die Lösung. Aliquoten zubereiten und bei -20 °C lagern.
HINWEIS: Ofloxacin ist ein Chinolon-Antibiotikum, das sowohl für wachsende als auch für nicht wachsende Bakterienzellen weit verbreitet ist14,21. Die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von OFX für E. coli MG1655-Zellen liegt im Bereich von 0,039–0,078 μg/ml19,20. Beachten Sie auch, dass andere Antibiotika wie Ampicillin und Kanamycin häufig in der Persisterforschung verwendet werden. Die Wahl der Antibiotika hängt von der Art der Studie ab. - E. coli MG1655-Zellbestände: Impfen Sie 2 ml normales LB-Medium mit einer einzigen Kolonie in einem 14-ml-Reagenzglas (Snap-Capped) und kultivieren Sie die Zellen in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 ° C. Wenn die Zellen die stationäre Phase erreichen, mischen Sie 500 μL der Zellkultur mit 500 μL 50% Glycerin (steril) in einer kryogenen Durchstechflasche und lagern Sie sie bei -80 °C.
2. Vermehrung von Zellen zur Eliminierung bereits vorhandener Persister
- Um eine Kultur über Nacht vorzubereiten, kratzen Sie eine kleine Menge Zellen aus einem gefrorenen Zellbestand mit einer sterilen Pipettenspitze (tauen Sie den Glycerinzellbestand nicht auf) und impfen Sie die Zellen in 2 ml modifiziertem LB-Medium in einem 14-ml-Snap-Capped-Reagenzglas. Die Zellen werden in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C für 12 h kultiviert.
- Erste Vermehrung
- Nach 12 h 250 μL Nachtkultur in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250 ml schallgefassten Kolben, der mit einer sterilen Aluminiumfolie bedeckt ist, übertragen.
- Züchten Sie die Zellkultur in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 °C, bis die Zellen die mittlere exponentielle Phase (OD600 = 0,5) erreichen.
- Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600)mit einem Mikroplattenleser alle 30 Minuten.
- Zweite Ausbreitung
- Bei OD600 = 0,5 werden 250 μL Zellkultur aus dem ersten Kolben in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250 ml schweren Kolben verdünnt.
- Die zweite Zellkultur wird in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C bis OD600=0,5 züchtet.
- Messen Sie die optische Dichte alle 30 Minuten.
HINWEIS: Eine Nachtkultur kann eine signifikante Menge an Persisterzellenaufweisen 4,5,22. Die oben beschriebene Verdünnungs-/Wachstumszyklusmethode5 kann verwendet werden, um diese bereits vorhandenen Persister zu eliminieren, bevor die Zellen auf Microarrays übertragen werden. Ihre Eliminierung kann durch Quantifizierung der Persister-Spiegel von Nachtkulturen mit dem in Protokoll 3 beschriebenen Assay validiert werden. Diese Methode wurde bereits in einer früheren Studie validiert19.
3. Validierung der Eliminierung bereits vorhandener Persisterzellen
- Nach der zweiten Vermehrung (siehe Schritt 2.3) werden 250 μL der Zellkultur (OD600 = 0,5) in 25 ml frischem modifiziertem LB-Medium in einem 250 ml schallgefassten Kolben verdünnt.
HINWEIS: Für Kontrollen 250 μL Nachtkultur (siehe Schritt 2.1) in 25 ml frischem modifiziertem LB-Medium in einem 250-ml-Schallkolben verdünnen. Vor dem Transfer der Zellen in den Kolben sollte die Zelldichte der Nachtkultur in frischem modifiziertem LB-Medium angepasst werden, um OD600 = 0,5 zu erhalten. - 25 μL OFX-Stammlösung (5 mg/ml) in die Zellsuspension geben und den Kolben vorsichtig schütteln, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Die Endkonzentration von OFX beträgt 5 μg/ml in der Assay-Kultur.
- Inkubieren Sie die Assay-Kultur in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C.
- Übertragen Sie zu jeder Stunde während der Behandlung (einschließlich 0 h, dem Zeitpunkt vor der Zugabe von OFX in die Assay-Kultur) 1 ml der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge die Assaykultur im Mikrozentrifugenröhrchen bei 17.000 x g für 3 min.
- Entfernen Sie vorsichtig 950 μL des Überstandes, ohne das Zellpellet zu stören.
- 950 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben.
- Wiederholen Sie die Waschschritte 3,5-3,7 für insgesamt 3x, bis die Antibiotikakonzentration unter der minimalen hemmenden Konzentration (MIC) liegt.
- Nach der abschließenden Wäsche wird das Zellpellet in 100 μL PBS-Lösung wieder aufgebraucht, was zu einer 10-fach konzentrierten Probe führt.
- Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie sechsmal in 90 μL PBS-Lösung mit einer 96-well-runden Bodenplatte.
- Spot 10 μL verdünnte Zellsuspensionen auf antibiotikafreien frischen Agarplatten. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, werden die verbleibenden 90 μL Zellsuspension auf einer frischen Agarplatte plattiert.
- Inkubieren Sie die Agarplatten bei 37 °C für 16 h und zählen Sie dann die koloniebildenden Einheiten (CFUs). Berücksichtigen Sie die Verdünnungsraten bei der Berechnung der Gesamtzahl der CFUs in 1 ml Assay-Kultur. Kill-Kurven werden generiert, indem die logarithmischen CFU-Werte in Bezug auf die Dauer der Antibiotikabehandlung dargestellt werden.
HINWEIS: Eine 6-h-OFX-Behandlung reicht aus, um eine biphasische Tötungskurve für E. coli-Zellen 19,20zu erhalten. Der Persistergehalt der vermehrten Zellen (gemessen anhand der CFU-Anzahl bei 6 h) sollte signifikant niedriger sein als der der Nachtkultur. Die in Protokoll 2 und 3 beschriebenen Verfahren können je nach Forschungsdesign mit regulärer LB durchgeführt werden.
4. Microarray-Platten-Screenings
- Herstellung von Microarray-Zellkulturen
- 250 μL Exponentialphasenzellen in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.
HINWEIS: Die Exponentialphasenzellen (OD600 = 0,5) werden aus dem zweiten Ausbreitungsschritt erhalten (siehe Schritt 2.3). - Die verdünnte Zellsuspension wird in ein steriles 50-ml-Reservoir überführen.
- Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 150 μL der Zellsuspension auf jede Vertiefung eines Microarrays, d. H. Eine 96-Well-Platte, die verschiedene Osmolyte enthält.
HINWEIS: Vertiefungen, die keine Osmolyte haben, dienen als Kontrollen. - Decken Sie das Microarray mit einer gasdurchlässigen Dichtmembran ab.
- Inkubieren Sie die Platte in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 24 h.
HINWEIS: In diesen Experimenten wurden kommerziell erhältliche Platten wie Phänotyp-Microarrays (PM-9 und PM-10) verwendet, die eine breite Palette von Osmolyten, pH-Puffern und anderen Chemikalien in getrocknetem Zustand in verschiedenen Konzentrationen enthalten. Diese Microarrays sind in halbfappigen 96-Well-Plattenformaten erhältlich. Das Kulturvolumen sollte je nach Art der verwendeten Platten angepasst werden. Microarrays können auch manuell generiert werden (siehe unten).
- 250 μL Exponentialphasenzellen in 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.
- Manuelle Vorbereitung von Microarray-Platten
- 75 μL 2x Osmolytlösungen in die Vertiefungen einer halbfrächtigen 96-Well-Platte geben.
- 500 μL Exponentialphasenzellen in 25 mL 2x modifiziertes LB-Medium in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen übertragen. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.
HINWEIS: Die Impfrate wurde angepasst, um mit dem in 4.1 beschriebenen Microarray-Screening-Protokoll übereinzukommen. - 75 μL der Zellsuspension in jede Vertiefung der halbfärbigen 96-Well-Platte mit 2x Osmolytlösungen geben.
- Inkubieren Sie die Platte in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 24 h.
- Vorbereitung von Persister-Assay-Platten
- Bereiten Sie 25 ml modifiziertes LB-Medium mit 5 μg/ml OFX in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen vor und geben Sie dieses Medium in ein steriles Reservoir.
- Übertragen Sie 190 μL modifiziertes LB-Medium mit OFX aus dem Reservoir in jede Vertiefung einer generischen Flachboden-96-Well-Platte (Persister-Assay-Platte) mithilfe einer Mehrkanalpipette.
- Entfernen Sie das Microarray aus dem Shaker (nach 24 h Kultivierung) und übertragen Sie 10 μL Zellkulturen aus dem Microarray in die Vertiefungen der Persister-Assay-Platte, die modifiziertes LB-Medium mit OFX enthält.
- Nehmen Sie 10 μL Zellsuspensionen von der Persister-Assay-Platte und verdünnen Sie sie dreimal in 290 μL PBS-Lösung mit einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und einer Mehrkanalpipette.
- Nach der seriellen Verdünnung werden 10 μL aller seriell verdünnten Zellsuspensionen auf antibiotikafreien frischen Agarplatten mit einer Mehrkanalpipette gefunden.
- Die Persister-Assay-Platte (vorbereitet in Schritt 4.3.3) wird in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 250 U/min für 6 h inkubiert, nachdem die Platte mit einer gasdurchlässigen Dichtungsmembran abgedeckt wurde.
- Nach 6 h Inkubation in einem Shaker nehmen Sie die Persister-Assay-Platte heraus und wiederholen die Schritte 4.3.4-4.3.5.
- Inkubieren Sie die Agarplatten für 16 h bei 37 °C und zählen Sie dann die CFUs. Die CFU-Werte vor und 6 h nach der Antibiotikabehandlung ermöglichen es, die Persisterfraktion in jeder Vertiefung zu berechnen. Die CFU-Zählungen vor der OFX-Behandlung helfen auch, die Auswirkungen von Osmolyten und auf die Lebensfähigkeit von E. coli zu beurteilen.
5. Validierung der ermittelten Bedingungen
- Transfer von 250 μL der exponentiellen Phasenzellen aus Schritt 2,3 auf 25 ml frisches modifiziertes LB-Medium, das den beim Microarray-Screening identifizierten Osmolyten enthält (siehe Protokoll 4).
- Inkubieren Sie den Kolben in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 °C für 24 h.
- Nach 24 h den Kolben aus dem Shaker nehmen und 250 μL der Zellkultur in 25 mL frisches modifiziertes LB-Medium in einem 250-ml-Schallkolben übertragen.
- 25 μL OFX-Stammlösung (5 mg/ml) in die Zellsuspension geben und den Kolben vorsichtig schütteln, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Inkubieren Sie den Kolben in einem Shaker bei 37 °C und 250 U/min.
- Übertragen Sie während der Behandlung stündlich 1 ml der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge die Assaykultur im Mikrozentrifugenröhrchen bei 17.000 x g für 3 min.
- Entfernen Sie 950 μL Überstand und fügen Sie 950 μL PBS hinzu.
- Wiederholen Sie die Waschschritte 5.6 und 5.7 für 3x.
- Nach der letzten Wäsche wird das Zellpellet in 100 μL PBS-Lösung wieder aufgebraucht.
- Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie 6x in 90 μL PBS-Lösung mit einer 96-well-runden Bodenplatte.
- Spot 10 μL der verdünnten Zellsuspensionen auf einer antibiotikafreien frischen Agarplatte. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, werden die verbleibenden 90 μL Zellsuspension auf einer frischen Agarplatte plattiert.
- Inkubieren Sie die Agarplatte bei 37 °C für 16 h und zählen Sie dann CFUs.
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Representative Results
Abbildung 1 beschreibt unser experimentelles Protokoll. Die Verdünnungs-/Wachstumszyklusexperimente (siehe Protokoll 2) wurden aus einer Studie von Keren et al.5 adaptiert, um die Persister aus den Nachtkulturen zu eliminieren. Abbildung 2A ist ein repräsentatives Bild von Agarplatten, die zur Bestimmung des KBE-Gehalts von Zellkulturen vor und nach der OFX-Behandlung verwendet werden. In diesen Experimenten wurden Zellen in modifiziertem LB-Medium mit Osmolyten in halbfädigen 96-Well-Platten kultiviert, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Nach der Inkubation der Platte in einem Orbitalschüttler für 24 h wurde der Persister-Assay mit einer generischen flachen Boden-96-Well-Platte durchgeführt (siehe Schritt 4.3). Die Osmolyte und die hier getestete Konzentration wurden auf der Grundlage unserer vorherigen Studie19ausgewählt, in der wir die Schritte 4.1 und 4.3 mit der PM-9-Platte durchgeführt haben, die verschiedene Osmolyte in verschiedenen Konzentrationen enthält (Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Ethylenglykol, Natriumformiat, Harnstoff, Natriumlactat, Natriumphosphat, Natriumbenzoat, Ammoniumsulfat, Natriumnitrit und Natriumnitrat). Die erste Spalte in Abbildung 2A zeigt die CFU-Anzahl der Kontrollgruppe. Die zweite Säule stellt einen Zustand dar, bei dem Zellen in 100 mM Natriumnitrat kultiviert wurden; Es wurde zuvor festgestellt, dass diese Bedingung die Persister-Level leicht erhöht19. Die dritte Säule stellt einen Zustand dar, bei dem Zellen in 60 mM Natriumnitrit kultiviert wurden, und dieser Zustand wurde zuvor festgestellt, dass er die Persisterspiegel im Vergleich zu den Kontrollen signifikant senkt19. Abbildung 2B ist eine grafische Darstellung der CFU-Daten, die von den Agarplatten erhalten wurden. Abbildung 2C zeigt die Persisterfraktionen der in 96 Wellplatten getesteten Zellkulturen. Um die Fraktionen zu berechnen, wurden die Persisterzahlen auf die Zellzahlen normalisiert, die vor den Antibiotikabehandlungen erhalten wurden. Abbildung 3 zeigt die biphasischen Tötungskurven bzw. die Persisterfraktionen für die Assaykulturen, die in verblüffeten Kolben durchgeführt wurden. In diesen Experimenten wurden die Zellen zunächst in 25 ml modifiziertem LB-Medium mit den angegebenen Osmolyten in 250-ml-Schallkolben für 24 h kultiviert und dann in Persister-Assay-Kolben zur Persister-Enumeration überführt, wie in Protokoll 5 beschrieben.
Abbildung 1: Das experimentelle Verfahren. Zellen aus einem gefrorenen Zellbestand wurden über Nacht (12 h) in frischem LB-Medium gezüchtet. Nach 12 h wurde die Nachtkultur in 25 ml modifiziertem LB-Medium verdünnt (1:100) und bis OD600= 0,5 gezüchtet. Dieser Ausbreitungsschritt wurde zweimal wiederholt. Nach dem letzten Ausbreitungsschritt wurden die exponentiellen Phasenzellen (bei OD600= 0,5) in frischem modifiziertem LB-Medium in einem 250-ml-Schallkolben bzw. einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen verdünnt (1:100). Die Zellsuspension im 250-ml-Schallkolben wurde mit 5 μg/ml OFX behandelt, um Persister zu quantifizieren. Die Zellsuspension im 50-ml-Zentrifugenröhrchen wurde auf Microarrays übertragen und 24 h in einem Orbitalschüttler bei 250 U/min und 37 °C inkubiert. Die Zellen aus den Microarrays wurden dann auf Persister-Assay-Platten übertragen, um Persister zu quantifizieren. Diese Figur wurde mit biorender.com erstellt. Diese Zahl wurde gegenüber unserer vorherigen Veröffentlichung19geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Microarray-Experimente. (A) Die Zellen wurden zunächst in modifiziertem LB-Medium mit oder ohne angezeigte Osmolyte in einer halbfädigen 96-Well-Platte für 24 h gezüchtet. Die Zellen wurden dann auf eine generische Flachboden-96-Well-Platte überführt und 6 h lang mit 5 μg/ml OFX behandelt. Vor und nach der 6-h-Behandlung wurden die Zellen seriell in PBS verdünnt, auf Agarplatten plattiert und bei 37 °C für 16 h inkubiert. Jede Bedingung hat 8 technische Replikate. (B) CFU-Messungen wurden durchgeführt, um die Auswirkungen von Osmolyten auf die Zelllebensfähigkeit bzw. Persistenz zu bewerten. Die gerade Linie zeigt die Nachweisgrenze an (600 CFUs). (C) Die Grafik stellt die Persisterfraktionen der Zellkulturen dar, berechnet durch das Verhältnis der CFU-Werte nach und vor der OFX-Behandlung. Der Persisteranteil der Zellkultur mit 60 mM Natriumnitrit wurde nicht berechnet, da sein Persistergehalt unter der Nachweisgrenze liegt. Jeder Datenpunkt wurde durch Mittelwert ± Standardabweichung bezeichnet, berechnet aus 8 technischen Replikaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Validierungsexperimente. (A) Exponentialphasenzellen wurden in 25 ml frischem modifiziertem LB-Medium mit angegebenen Osmolyten in 250-ml-Kolben überführt und 24 h lang kultiviert. Anschließend wurden die Zellen in 250 ml geblendeten Kolben mit 25 ml modifiziertem LB-Medium verdünnt (1:100) und 6 h lang mit 5 μg/ml OFX behandelt. Die CFU-Zählungen in den Assay-Kulturen wurden stündlich überwacht, um biphasische Tötungskurven zu erzeugen. * gibt die Bedingung an, die die OFX-Persister-Spiegel im Vergleich zu No-Osmolyte-Kontrollen signifikant beeinflusst (zweiseitiger ungleicher Varianz-t-Test, s<0,05). (B) Die Grafik stellt die persisteren Brüche der Kulturen dar. Jeder Datenpunkt wurde mit Mittelwert ± Standardabweichung bezeichnet, berechnet aus 3 biologischen Replikaten. Diese Zahl wurde gegenüber unserer vorherigen Veröffentlichung19geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Der hier beschriebene Hochdurchsatz-Persister-Assay wurde entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Chemikalien auf die Persistenz von E. coli aufzuklären. Zusätzlich zu kommerziellen PM-Platten können Microarrays manuell konstruiert werden, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Darüber hinaus ist das hier vorgestellte Protokoll flexibel und kann verwendet werden, um andere Microarrays wie Drug Panels und Zellbibliotheken zu screenen, die in 96 Well-Plate-Formaten vorliegen. Die experimentellen Bedingungen einschließlich der Wachstumsphase, der Impfrate und des Mediums können angepasst werden, um diese Bibliotheken zu testen. Wenn man beispielsweise eine Zellbibliothek wie Keio E. coli knockout collection23screenen möchte, kann man die Stämme zuerst mit einer Mehrkanalpipette aus der Bibliothek auf 96 Well-Platten übertragen, die frische Medien enthalten. Sobald die Zellen die gewünschte Wachstumsphase erreicht haben (z. B. exponentielle oder stationäre Phase), werden die Zellen auf Persister-Assay-Platten wie in Schritt 4.3 beschrieben übertragen, um die Persister-Ebenen der Knockout-Stämme aufzuzählen. In ähnlicher Weise kann diese Strategie verwendet werden, um die E. coli Promoter-Sammlung 24 (eine Bibliothek fluoreszierender Reporterstämme in 96 Well-Plate-Formaten) zu screenen, um Promotoren zu identifizieren, die durch Antibiotika aktiviert werden. Diese Promotoren können leicht nachgewiesen werden, indem die Fluoreszenzsignale von Stämmen in Persister-Assay-Platten während der Antibiotikabehandlung gemessen werden.
In unseren Experimenten haben wir ein modifiziertes LB (ohne NaCl) verwendet, um zusätzliche Effekte zu vermeiden, die durch NaCl entstehen könnten, da die Microarrays bereits verschiedene Osmolyte haben. Obwohl bekannt ist, dass NaCl in normalem LB-Medium gut für die Erhaltung der Membranintegrität von Zellen ist, wurde berichtet, dass NaCl im Bereich von 0-1% einen minimalen Einfluss auf das Zellwachstum hat25. Darüber hinaus haben Ergebnisse von Propidiumiodid (PI)-Färbungen und Persister-Assays in unserer vorherigen Studie gezeigt, dass das Fehlen von NaCl die Membranintegrität und die Persistenz von E. coli-Zellen nicht signifikant beeinflusst19. Diese Modifikation wurde speziell vorgenommen, um die Bedenken in unserer Studie zu berücksichtigen und kann basierend auf der Art der Forschung geändert werden.
Wir haben auch eine von Keren et al.5 entwickelte Methode angepasst, um bereits vorhandene Persister in unseren Zellkulturen vor der Impfung in die Microarrays zu eliminieren. Es ist bekannt, dass Typ-I-Persister während der stationären Phase erzeugt werden; Daher würde die direkte Impfung der Zellen aus Nachtkulturen in Microarray-Platten eine signifikante Anzahl von Persistern übertragen, was die Wirkung von Osmolyten behindern könnte. Mit den Verdünnungs-/Wachstumszyklusexperimenten (siehe Protokoll 2) konnten wir diese bereits vorhandenen Persister, die aus den Nachtkulturen entstehen, signifikant reduzieren19. Wir stellen fest, dass wir die Zellen in Microarray-Platten für 24 Stunden kultiviert haben, um alle Persister zählen zu können, einschließlich Typ-I-Varianten, die während der stationären Phase in Gegenwart von Osmolyten gebildet werden. Diese angepassten Techniken können jedoch immer je nach Art der Studie modifiziert werden.
Wir behandelten die Zellen in Microarrays mit 5 μg/ml OFX, um die Persister aufzuzählen. Da der Waschvorgang zur Entfernung des Antibiotikums aus 96 Proben sehr arbeitsintensiv wäre, wurden die Zellen nach der Behandlung ohne Waschen seriell in PBS verdünnt (siehe Schritt 4.2). Dieses Verfahren verdünnte die OFX-Konzentration um mehr als das 30-fache. Die verdünnten Zellsuspensionen wurden dann auf antibiotikafreie Agarplatten plattiert, wo das OFX weiter dispergiert wurde. Unsere Vorstudien, in denen wir diese Experimente mit und ohne Waschen wiederholten, haben bestätigt, dass diese serielle Verdünnungsmethode die Persister-Spiegel19nicht beeinflusste.
Während der Mehrkanalpipetierung in 96 Vertiefungsplatten sollte man die Zellsuspensionen vorsichtig mischen, um eine homogene Zellverteilung aufrechtzuerhalten. Um dies zu tun, wäre es je nach Arbeitsvolumen von Vorteil, die minimale Anzahl von Pipettieren zu beachten, die erforderlich ist, um die Lösung homogen zu machen. Zu diesem Zweck führten wir ein einfaches Kontrollexperiment durch, bei dem wir die Pipettierung (auf und ab) überwachten, indem wir ein Farbstoffmolekül in PBS und Medium unter den hier untersuchten Bedingungen dispergierten. Wenn wir mit komplexeren Umgebungen wie pH-Puffern arbeiten, empfehlen wir außerdem, den pH-Wert der Zellkultur vor und während der Inkubation in einem Shaker zu messen, da die Zellkultur im Laufe der Zeit sehr alkalisch (pH-≈ 8) ist. Dies kann eine Vorstellung von der Qualität sowie dem pH-Bereich des verwendeten Puffers geben. Um abzählbare CFUs auf Agarplatten aus den Hochdurchsatz-Assays zu erhalten, sollten bestimmte Bedingungen wie die Zellimpfungsrate, das Alter der Kulturen und die seriellen Verdünnungsparameter (PBS-Volumen, Verdünnungsraten und die Anzahl der Verdünnungsschritte usw.) vor dem Testen der Microarrays optimiert werden. Schließlich sollten die ergebnisse der Microarrays in Kolben weiter validiert werden, da das Volumen der Kultur, die Oberfläche und die Belüftung in einer 96-Well-Platte zusätzliche Auswirkungen auf die beobachteten Ergebnisse haben könnten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Orman Lab für ihre wertvollen Beiträge während dieser Studie. Diese Studie wurde durch den NIH / NIAID K22AI125468 Career Transition Award und ein Startup-Stipendium der University of Houston finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-ml test tube | Fisher Scientific | 14-959-1B | |
| E. coli strain MG1655 | Princeton University | Obtained from Brynildsen lab | |
| Flat-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-5161 | |
| Gas permeable sealing membrane | VWR | 102097-058 | Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins |
| Half-area flat-bottom 96-well plate | VWR | 82050-062 | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-2 | Molecular genetics grade |
| Ofloxacin salt | VWR | 103466-232 | HPLC ≥97.5 |
| Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) | Biolog | N/A | PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively |
| Round-bottom 96-well plate | USA Scientific | 5665-0161 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | Certified ACS grade |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | AC424345000 | ACS reagent grade |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | AAA186680B | 98% purity |
| Square petri dish | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | Molecular genetics grade |
| Varioskan lux multi mode microplate reader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 | Used for optical density measurement at 600 nm |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-100 | Molecular genetics grade |
References
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