Denne protokollen presenterer en tilnærming til fingeravtrykk og utforsker flerdimensjonale data samlet inn av omfattende todimensjonal gasskromatografi kombinert med massespektrometri. Dedikerte mønstergjenkjenningsalgoritmer (malmatching) brukes til å utforske den kjemiske informasjonen som er kryptert i den ekstra jomfruelige olivenolje flyktige fraksjonen (dvs. volatilome).
Databehandling og evaluering er kritiske trinn i omfattende todimensjonal gasskromatografi (GCxGC), spesielt når den kobles til massespektrometri. Den rike informasjonen som krypteres i dataene, kan være svært verdifull, men vanskelig å få tilgang til effektivt. Datatetthet og kompleksitet kan føre til lange utdypingstider og kreve arbeidskrevende, analytikeravhengige prosedyrer. Effektive, men tilgjengelige databehandlingsverktøy er derfor nøkkelen til å muliggjøre spredning og aksept av denne avanserte flerdimensjonale teknikken i laboratorier for daglig bruk. Dataanalyseprotokollen som presenteres i dette arbeidet bruker kromatografisk fingeravtrykk og malmatching for å oppnå målet om svært automatisert dekonstruksjon av komplekse todimensjonale kromatogrammer i individuelle kjemiske egenskaper for avansert anerkjennelse av informative mønstre innen individuelle kromatogrammer og på tvers av sett med kromatogrammer. Protokollen gir høy konsistens og pålitelighet med liten inngripen. Samtidig er analytikertilsyn mulig i en rekke innstillinger og begrensningsfunksjoner som kan tilpasses for å gi fleksibilitet og kapasitet til å tilpasse seg ulike behov og mål. Malmatching vises her for å være en kraftig tilnærming for å utforske ekstra virgin olivenolje volatilome. Kryssjustering av topper utføres ikke bare for kjente mål, men også for umålte forbindelser, noe som øker karakteriseringskraften betydelig for et bredt spekter av applikasjoner. Eksempler presenteres for å bevise ytelsen for klassifisering og sammenligning av kromatografiske mønstre fra prøvesett analysert under lignende forhold.
Omfattende todimensjonal gasskromatografi kombinert med tid-of-flight massespektrometrisk deteksjon (GC×GC-TOF MS) er i dag den mest informative analytiske tilnærmingen for kjemisk karakterisering av komplekse prøver1,2,3,4,5. I GC×GC kobles kolonner serielt sammen og kobles sammen av en modulator (f.eks. et termisk eller ventilbasert fokuseringsgrensesnitt) som fanger elutingkomponenter fra den første dimensjonskolonnen (1D) før de injiseres på nytt i den andre dimensjonskolonnen (2D). Denne operasjonen utføres innenfor en fast modulasjonstidsperiode (PM), vanligvis mellom 0,5 og 8 s. Ved termisk modulasjon inkluderer prosessen kryo-fangst og fokusering av elutingsbåndet med noen fordeler for den generelle separasjonskraften.
Selv om GC×GC er en todimensjonal separasjonsteknikk, produserer prosessen sekvensielle dataverdier. Detektorens analog-til-digital (A/D) omformer får den kromatografiske signalutgangen med en viss frekvens. Deretter lagres data i spesifikke proprietære formater som ikke bare inneholder de digitaliserte dataene, men også relaterte metadata (informasjon om dataene). A/D-omformeren som brukes i GC×GC-systemer hjelper til med å kartlegge intensiteten til det kromatografiske signalet til et digitalt nummer (DN) som en funksjon av tid i de to analytiske dimensjonene. Enkanalsdetektorer (f.eks. flammeioniseringsdetektor (FID), elektronfangstdetektor (ECD), svovel chemiluminescence detector (SCD), etc.) produserer enkeltverdier per prøvetid, mens flerkanalsdetektorer (f.eks. massespektrometrisk detektor (MS)) produserer flere verdier (vanligvis over et spektralt område) per prøvetid langs analyseløpet.
For å visualisere 2D-datastarter utarbeidelsen med rastrering av en enkelt modulasjonsperiode (eller syklus) dataverdier som en kolonne med piksler (bildeelementer som tilsvarer detektorhendelser). Langs ordinatet (Y-akse, bunn-til-topp) visualiseres 2D-separasjonstiden. Pikselkolonner behandles sekvensielt slik at abscissa (X-aksen, venstre mot høyre) rapporterer 1D-separasjonstid. Denne sorteringen presenterer 2D-dataenei et høyrehendt kartesisk koordinatsystem, med 1D-oppbevaringsordinal som den første indeksen i matrisen.
Databehandling av 2D-kromatogrammer gir tilgang til et høyere informasjonsnivå enn rådata, noe som muliggjør 2D toppdeteksjon, toppidentifikasjon, utvinning av responsdata for kvantitativ analyse og krysskomparativ analyse.
2D-toppmønstrene kan behandles som prøvens unike fingeravtrykk og oppdagede forbindelser som minutiae-funksjoner for effektiv kryss-komparativ analyse. Denne fremgangsmåten, kjent som malbasert fingeravtrykk6,7, ble inspirert av biometrisk fingeravtrykk6. Automatiske biometriske fingeravtrykksverifiseringssystemer er faktisk avhengige av unike fingertuppegenskaper: bifurkasjoner og avslutninger på åsen, lokalisert og hentet fra blekkede inntrykk eller detaljerte bilder. Disse egenskapene, kalt minutiae-funksjoner, tilpasses deretter med tilgjengelige lagrede maler8,9.
Som nevnt ovenfor består hvert GC×GC-separasjonsmønster av 2D-topper rasjonelt fordelt over et todimensjonalt plan. Hver topp tilsvarer en enkelt analytt, har sitt informative potensial, og kan behandles som en enkelt funksjon for komparativ mønsteranalyse.
Her presenterer vi en effektiv tilnærming for kjemisk fingeravtrykk av GC×GC-TOF MS med tandemionisering. Målet er å omfattende og kvantitativt katalogisere funksjoner fra et sett med kromatogrammer.
Sammenlignet med eksisterende kommersiell programvare eller internerutiner 10,11 som bruker en toppfunksjoner tilnærming, er malbasert fingeravtrykk preget av høy spesifisitet, effektivitet og begrenset beregningstid. I tillegg har den en egen fleksibilitet som muliggjør kryssjustering av minutia-funksjoner (dvs. 2D-topper) mellom alvorlig feiljusterte kromatogrammer som de som er anskaffet ved annen instrumentering eller i langtidsrammestudier12,13,14.
De grunnleggende operasjonene til den foreslåtte metoden er beskrevet kort for å veilede leseren til en god forståelse av 2D-mønsterkompleksiteten og informasjonskraften. Deretter, ved å utforske instrumentets utgangsdatamatrise, utføres kjemisk identifikasjon og kjente målrettede analytter som ligger over det todimensjonale rommet. Malen med målrettede topper bygges deretter og brukes på en rekke kromatogrammer som er anskaffet innenfor samme analytiske batch. Metadata relatert til oppbevaringstider, spektralsignaturer og svar (absolutte og relative) hentes fra omjusterte mønstre med målrettede topper og vedtas for å avdekke sammensetningsforskjeller i eksempelsettet.
Som et ekstra, unikt trinn i prosessen utføres også et kombinert umålt og målrettet (UT) fingeravtrykk på forhåndsmålrettede kromatogrammer for å utvide fingeravtrykkspotensialet til både kjente og ukjente analytter. Prosessen produserer en UT-mal for en virkelig omfattende komparativ analyse som i stor grad kan automatiseres.
Som et siste trinn utfører metoden kryssjustering av funksjoner i to parallelle detektorsignaler produsert med høy og lav elektronioniseringsenergi (70 og 12 eV).
Protokollen er ganske fleksibel i å støtte analyser av et enkelt kromatogram eller et sett med kromatogrammer og med variabel kromatografi og/eller flere detektorer. Her demonstreres protokollen med en kommersielt tilgjengelig GC×GC-programvarepakke (se Tabell over materialer) kombinert med et MS-bibliotek og søkeprogramvare (se Tabell over materialer). Noen av de nødvendige verktøyene er tilgjengelige i annen programvare, og lignende verktøy kan implementeres uavhengig av beskrivelser i litteraturen av Reichenbach og medarbeidere15,16,17,18,19. Rådata for demonstrasjonen er avledet fra en forskningsstudie om extra-virgin oliven (EVO) olje utført i forfatternes laboratorium14. Spesielt er den flyktige fraksjonen (dvs. volatilome) av italienske EVO-oljer samplet av headspace solid phase microextraction (HS-SPME) og analysert av GC×GC-TOF MS for å fange diagnostiske fingeravtrykk for kvalitet og sensorisk kvalifisering av prøver. Du finner detaljer om prøver, prøvetakingsbetingelser og analytisk oppsett i Materialfortegnelser.
Trinn 1–6 beskriver forhåndsbehandling av kromatogrammer. Trinn 7–9 beskriver behandling og analyse av individuelle kromatogrammer. Trinn 10–12 beskriver oppretting og samsvar av maler, som er grunnlaget for analyse på tvers av utvalg. Trinn 13–16 beskriver bruk av protokollen på tvers av et sett med kromatogrammer, med trinn 14–16 for UT-analyse.
Visualisering av GC×GC-TOF MS-data er et grunnleggende skritt for en hensiktsmessig forståelse av resultatene oppnådd ved omfattende todimensjonale separasjoner. Bildeplott med tilpasset fargelegging gjør det mulig for analytikere å sette pris på detektorresponsforskjeller og dermed differensialfordelingen av prøvekomponenter. Denne visuelle tilnærmingen endrer analytikernes perspektiv fullstendig på tolkning og utarbeidelse av kromatogrammer. Dette første trinnet, når det er forstått og trygt brukt av kromatografer, åpner et nytt perspektiv i videre behandling.
Et annet grunnleggende aspekt ved databehandling er tilgjengeligheten til hele datamatrisen (dvs. MS-spektraldata og svar) for alle prøvepunkter, som hver tilsvarer en enkelt detektorhendelse. I denne forbindelse topper 2D integrasjonen, slik at innsamlingen av detektorhendelser som tilsvarer en enkelt analytt representerer et kritisk skritt. I den nåværende protokollen er 2D-topper deteksjon basert på vannskillealgoritmen18 med noen tilpasninger inkludert for å forbedre deteksjonsfølsomheten i tilfelle delvise ko-eluting forbindelser. For å gjøre denne prosessen mer spesifikk, må dekonvolusjon gjøres, og mer sofistikerte prosedyrer vedtatt. Dette er mulig ved å utføre en ion peak deteksjon for MS-data; Algoritmen behandler datamatrisen og isolerer svaret fra enkeltanalytter basert på spektralprofiler19,31.
Et viktig, men kritisk trinn i protokollen, og for enhver GC×GC-MS-datatolkningsprosess, er relatert til analytteridentifikasjon. Denne prosedyren, som foreslås i trinn 8 og 9, i fravær av en bekreftende analyse med autentiske standarder, må utføres nøye av analytikeren. Automatiserte handlinger er tilgjengelige i all kommersiell programvare; De inkluderer MS spektral signatur likhetsevaluering mot den innsamlede referansespektra (dvs. spektralbiblioteker) og evaluering av karakteristiske forhold blant kvalifikator / kvantifikatorioner. Imidlertid er det nødvendig med ytterligere bekreftende kriterier for å tvetydig identifikasjon av isomerer. Protokollen foreslår å ta i bruk lineære oppbevaringsindekser for å prioritere listen over kandidater; Grensen her gjelder tilgjengeligheten av oppbevaringsdata og dens konsistens.
Hovedkarakteristikken som gjør denne fremgangsmåten unik, er malen som samsvarer med12,13,15,29. Malmatching muliggjør 2D-mønstergjenkjenningpå en svært effektiv, spesifikk og intuitiv måte. Den kan angis, når det gjelder følsomhet og spesifisitet, ved å bruke tilpassede terskelverdier og/eller begrensningsfunksjoner, mens analytikeren kan overvåke prosedyren ved å samhandle aktivt med transformeringsfunksjonsparametere. Egenheten ved denne prosessen er avhengig av muligheten til å kryssjustere målrettede og umålte topper informasjon mellom prøver av en jevn batch, men også mellom prøver som er anskaffet med de samme nominelle forholdene til tross for middels til alvorlig feiljustering. Fordelene ved denne operasjonen er knyttet til muligheten til å bevare alle målrettede analytter identifikasjoner, som er en tidkrevende oppgave for analytikeren, og alle metadata lagret for målrettede og umålte topper fra tidligere utarbeidelsesøkter.
Malmatching er også veldig effektiv når det gjelder beregningstid; lavoppløselige MS-datafiler består av omtrent 1-2 Gb pakket data, mens høyoppløselige MS-analyser kan nå 10-15 Gb per enkelt analytisk kjøring. Malmatching behandler ikke hele datamatrisen hver gang, men utfører først justering av oppbevaringstid mellom kromatogrammer ved hjelp av maltopper, og behandler deretter kandidattopper i søkevinduet for å finne likhetssamsvaret med referanse i malen. Ved alvorlig feiljustering, den mest utfordrende situasjonen, utførte globale flerordens polynomtransformasjoner bedre enn lokale metoder samtidig som beregningstiden13reduseres.
For at GC×GC-teknikken skal spre seg vidt utover akademia og forskningslaboratorier, må databehandlingsverktøy legge til rette for grunnleggende operasjoner for visualisering og kromatogrammer inspeksjon; identifisering av analytter bør gi mulighet til å ta i bruk standardiserte algoritmer og prosedyrer (f.eks. NIST-søkealgoritme og I T-kalibrering); og kryss-komparativ analyse bør være intuitiv, effektiv og støttet av interaktive verktøy. Den foreslåtte tilnærmingen dekker disse behovene samtidig som den tilbyr avanserte alternativer og verktøy for å håndtere komplekse situasjoner som analytter co-elution, flere analytter kalibrering, gruppe-type analyse og parallell deteksjon justering.
Den refererte litteraturen dekker godt mange mulige scenarier der GC×GC og, mer generelt, omfattende todimensjonal kromatografi, tilbyr unike løsninger og pålitelige resultater som ikke kan oppnås ved 1D-kromatografi i enkeltkjøringsanalyse. 5,32,33 Selv om GC×GC er det kraftigste verktøyet som øker separasjonskapasiteten og følsomheten, er det alltid begrensninger for separasjonskraft, følsomhet og andre systemiske kapasiteter. Etter hvert som disse systemiske grensene nærmer seg, blir dataanalysen gradvis vanskeligere. Derfor må forskning og utvikling fortsette å forbedre de analytiske verktøyene vi har til rådighet.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen ble støttet av Progetto Ager − Fondazioni i rete per la ricerca agroalimentare. Prosjekt akronym Fiolin – Valorisering av italienske olivenprodukter gjennom innovative analytiske verktøy (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). GC Image-programvare er tilgjengelig for en gratis prøveperiode for lesere som ønsker å demonstrere og teste protokollen.
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |