Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für Den Fingerabdruck dar und untersucht mehrdimensionale Daten, die durch eine umfassende zweidimensionale Gaschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie gesammelt werden. Spezielle Mustererkennungsalgorithmen (Template Matching) werden angewendet, um die chemischen Informationen zu untersuchen, die in der flüchtigen Fraktion des nativen Olivenöls extra (d. H. Volatilom) verschlüsselt sind.
Datenverarbeitung und -auswertung sind kritische Schritte der umfassenden zweidimensionalen Gaschromatographie (GCxGC), insbesondere in Verbindung mit der Massenspektrometrie. Die reichhaltigen Informationen, die in den Daten verschlüsselt sind, können sehr wertvoll sein, aber schwer effizient zugänglich sein. Datendichte und -komplexität können zu langen Ausarbeitungszeiten führen und erfordern mühsame, analystenabhängige Verfahren. Effektive und dennoch zugängliche Datenverarbeitungswerkzeuge sind daher der Schlüssel, um die Verbreitung und Akzeptanz dieser fortschrittlichen mehrdimensionalen Technik in Laboren für den täglichen Gebrauch zu ermöglichen. Das in dieser Arbeit vorgestellte Datenanalyseprotokoll verwendet chromatographische Fingerabdrücke und Vorlagenabgleich, um das Ziel der hochautomatisierten Dekonstruktion komplexer zweidimensionaler Chromatogramme in einzelne chemische Merkmale zu erreichen, um informative Muster innerhalb einzelner Chromatogramme und über Chromatogramme hinweg zu erkennen. Das Protokoll bietet eine hohe Konsistenz und Zuverlässigkeit mit wenig Eingriffen. Gleichzeitig ist die Analystenaufsicht in einer Vielzahl von Einstellungen und Einschränkungsfunktionen möglich, die angepasst werden können, um Flexibilität und Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Bedürfnisse und Ziele zu bieten. Der Vorlagenabgleich wird hier als leistungsstarker Ansatz zur Erforschung des nativen Olivenölvolatiloms extra gezeigt. Die Kreuzausrichtung von Peaks wird nicht nur für bekannte Targets, sondern auch für ungezielte Verbindungen durchgeführt, was die Charakterisierungsleistung für eine Vielzahl von Anwendungen signifikant erhöht. Es werden Beispiele vorgestellt, um die Leistung für die Klassifizierung und den Vergleich chromatographischer Muster aus Probensätzen zu belegen, die unter ähnlichen Bedingungen analysiert wurden.
Die umfassende zweidimensionale Gaschromatographie in Kombination mit der flugzeitspektrometrischen Detektion (GC×GC-TOF MS) ist heute der informativste analytische Ansatz zur chemischen Charakterisierung komplexer Proben1,2,3,4,5. Bei GC×GC werden Säulen seriell verbunden und durch einen Modulator (z. B. eine thermische oder ventilbasierte Fokussierschnittstelle) verbunden und verbunden, der eluierende Komponenten aus der ersten Dimension(1D) -Säule einfängt, bevor sie wieder in die zweite Dimension(2D) -Säule eingesiebt werden. Diese Operation wird innerhalb einer festen Modulationszeitspannperiode (PM) durchgeführt, die im Allgemeinen zwischen 0,5 und 8 s liegt. Durch thermische Modulation umfasst der Prozess kryo-trapping und Fokussierung des Eluierungsbandes mit einigen Vorteilen für die gesamte Trennleistung.
Obwohl GC×GC eine zweidimensionale Trenntechnik ist, erzeugt der Prozess sequenzielle Datenwerte. Der Analog-Digital-Wandler (A/D) des Detektors erhält den chromatographischen Signalausgang bei einer bestimmten Frequenz. Dann werden die Daten in bestimmten proprietären Formaten gespeichert, die nicht nur die digitalisierten Daten, sondern auch zugehörige Metadaten (Informationen über die Daten) enthalten. Der in GC×GC-Systemen verwendete A/D-Wandler hilft dabei, die Intensität des chromatographischen Signals auf eine digitale Zahl (DN) als Funktion der Zeit in den beiden analytischen Dimensionen abzubilden. Einkanaldetektoren (z. B. Flammenionisationsdetektor (FID), Elektroneneinfangdetektor (ECD), Schwefelchemilumineszenzdetektor (SCD) usw.) erzeugen Einzelwerte pro Probenahmezeit, während Mehrkanaldetektoren (z. B. Massenspektrometrischer Detektor (MS)) mehrere Werte (typischerweise über einen Spektralbereich) pro Probenahmezeit entlang des Analyselaufs erzeugen.
Um 2D-Datenzu visualisieren, beginnt die Ausarbeitung mit der Rasterung von Datenwerten einer einzelnen Modulationsperiode (oder eines Zyklus) als Pixelspalte (Bildelemente, die Detektorereignissen entsprechen). Entlang der Ordinate (Y-Achse, von unten nach oben) wird die 2D-Trennzeit visualisiert. Pixelspalten werden sequenziell verarbeitet, so dass die Abszisse (X-Achse, von links nach rechts) eine Trennzeitvon 1 D meldet. Diese Reihenfolge stellt die 2-D-Daten in einemrechtshändigen kartesischen Koordinatensystem dar, wobei die 1-D-Retentionsordinalzahl als erster Index in das Array aufgenommen wird.
Die Datenverarbeitung von 2D-Chromatogrammen ermöglicht den Zugriff auf ein höheres Informationsniveau als Rohdaten und ermöglicht die 2D-Peak-Erkennung,Peak-Identifizierung, Extraktion von Antwortdaten für quantitative Analysen und cross-vergleichende Analysen.
Die 2-D-Peakmuster können als einzigartiger Fingerabdruck der Probe und nachgewiesene Verbindungen als Minutienmerkmale für eine effektive crossvergleichende Analyse behandelt werden. Dieser Ansatz, bekannt als template-based fingerprinting6,7, wurde vom biometrischen Fingerabdruck6inspiriert. Automatische biometrische Fingerabdruck-Verifizierungssysteme basieren in der Tat auf einzigartigen Fingerspitzeneigenschaften: Kammverzweigungen und -enden, lokalisiert und extrahiert aus eingefärbten Abdrücken oder detaillierten Bildern. Diese Merkmale, die als Minutien-Features bezeichnet werden, werden dann mit den verfügbaren gespeicherten Vorlagen8,9abgeglichen.
Wie oben erwähnt, besteht jedes GC×GC-Trennmuster aus 2D-Peaks, die rational über eine zweidimensionale Ebene verteilt sind. Jeder Peak entspricht einem einzelnen Analyten, hat sein informatives Potenzial und kann als einzelnes Merkmal für die vergleichende Musteranalyse behandelt werden.
Hier stellen wir einen effektiven Ansatz für den chemischen Fingerabdruck mittels GC×GC-TOF MS mit Tandemionisation vor. Ziel ist es, Features aus einer Reihe von Chromatogrammen umfassend und quantitativ zu katalogisieren.
Im Vergleich zu bestehender kommerzieller Software oder internen Routinen10,11, die einen Peak-Features-Ansatz verwenden, zeichnet sich vorlagenbasiertes Fingerprinting durch hohe Spezifität, Effizienz und begrenzte Rechenzeit aus. Darüber hinaus verfügt es über eine intrinsische Flexibilität, die die Kreuzausrichtung von Minutienmerkmalen (d. H. 2D-Peaks) zwischen stark falsch ausgerichteten Chromatogrammen ermöglicht, wie sie durch verschiedene Instrumente oder in Langzeitrahmenstudien erworben wurden12,13,14.
Die grundlegenden Operationen der vorgeschlagenen Methode werden kurz beschrieben, um den Leser zu einemguten Verständnis der 2D-Musterkomplexität und Informationskraft zu führen. Durch die Untersuchung der Ausgabedatenmatrix des Instruments wird dann eine chemische Identifizierung durchgeführt und bekannte Zielanalyten befinden sich über dem zweidimensionalen Raum. Die Vorlage der zielgerichteten Peaks wird dann erstellt und auf eine Reihe von Chromatogrammen angewendet, die innerhalb derselben analytischen Charge erfasst wurden. Metadaten in Bezug auf Retentionszeiten, spektrale Signaturen und Antworten (absolut und relativ) werden aus neu ausgerichteten Mustern von Zielpeaks extrahiert und übernommen, um Kompositorische Unterschiede im Probensatz aufzudecken.
Als zusätzlicher, einzigartiger Schritt des Prozesses wird auch ein kombinierter ungezielter und gezielter Fingerabdruck (UT) an prägezielten Chromatogrammen durchgeführt, um das Fingerabdruckpotenzial sowohl auf bekannte als auch auf unbekannte Analyten auszudehnen. Der Prozess erstellt eine UT-Vorlage für eine wirklich umfassende vergleichende Analyse, die weitgehend automatisiert werden kann.
In einem letzten Schritt führt das Verfahren die Kreuzausrichtung von Merkmalen in zwei parallelen Detektorsignalen durch, die mit hohen und niedrigen Elektronenionisationsenergien (70 und 12 eV) erzeugt werden.
Das Protokoll ist sehr flexibel bei der Unterstützung von Analysen eines einzelnen Chromatogramms oder einer Reihe von Chromatogrammen und mit variabler Chromatographie und / oder mehreren Detektoren. Hier wird das Protokoll mit einer handelsüblichen GC×GC Software Suite (siehe Materialtabelle)kombiniert mit einer MS Library und Suchsoftware (siehe Materialtabelle)demonstriert. Einige der notwendigen Werkzeuge sind in anderer Software vorhanden und ähnliche Tools könnten unabhängig von Beschreibungen in der Literatur von Reichenbach und Mitarbeitern15 , 16,17,18,19implementiert werden. Die Rohdaten für die Demonstration stammen aus einer Forschungsstudie zu nativem Olivenöl extra (EVO), die im Labor der Autoren durchgeführt wurde14. Insbesondere die flüchtige Fraktion (d. h. das Volatilom) italienischer EVO-Öle wird durch Headspace-Festphasenmikroextraktion (HS-SPME) beprobt und von GC×GC-TOF MS analysiert, um diagnostische Fingerabdrücke für die Qualität und sensorische Qualifizierung von Proben zu erfassen. Einzelheiten zu Proben, Probenahmebedingungen und analytischem Aufbau finden Sie in der Materialtabelle.
Die Schritte 1–6 beschreiben die Vorverarbeitung der Chromatogramme. Die Schritte 7–9 beschreiben die Verarbeitung und Analyse einzelner Chromatogramme. Die Schritte 10 bis 12 beschreiben die Vorlagenerstellung und den Abgleich, die die Grundlage für die stichprobenübergreifende Analyse sind. Die Schritte 13 bis 16 beschreiben die Anwendung des Protokolls auf eine Reihe von Chromatogrammen, wobei die Schritte 14 bis 16 für die UT-Analyse vorgesehen sind.
Die Visualisierung von GC×GC-TOF MS-Daten ist ein grundlegender Schritt für ein angemessenes Verständnis der Ergebnisse, die durch umfassende zweidimensionale Trennungen erzielt werden. Bildplots mit kundenspezifischer Einfärbung ermöglichen es Analysten, Detektorreaktionsunterschiede und damit die differentielle Verteilung der Probenkomponenten zu schätzen. Dieser visuelle Ansatz verändert die Perspektive der Analysten auf die Interpretation und Ausarbeitung von Chromatogrammen völlig. Dieser erste Schritt, einmal verstanden und von Chromatographen souverän genutzt, eröffnet eine neue Perspektive in der weiteren Verarbeitung.
Ein weiterer grundlegender Aspekt der Datenverarbeitung ist die Zugänglichkeit der vollständigen Datenmatrix (d. H. MS-Spektraldaten und -antworten) für alle Probenpunkte, von denen jeder einem einzigen Detektorereignis entspricht. In dieser Hinsicht erreicht 2D Peaks Integration, so dass die Erfassung von Detektorereignissen, die einem einzelnen Analyten entsprechen, einen kritischen Schritt darstellt. Im aktuellen Protokoll basiert die 2-D-Peaks-Detektion auf dem Watershed-Algorithmus18 mit einigen Anpassungen, um die Detektionsempfindlichkeit bei partiellen co-eluierenden Verbindungen zu verbessern. Um diesen Prozess spezifischer zu gestalten, muss eine Dekonvolution durchgeführt und ausgefeiltere Verfahren eingeführt werden. Dies ist möglich, indem eine Ionenspitzenerkennung für MS-Daten durchführt; Der Algorithmus verarbeitet das Datenarray und isoliert die Antwort von einzelnen Analyten basierend auf Spektralprofilen19,31.
Ein wichtiger, aber kritischer Schritt des Protokolls und jedes GC×GC-MS-Dateninterpretationsprozesses bezieht sich auf die Identifizierung von Analyten. Dieses Verfahren, das in den Schritten 8 und 9 vorgeschlagen wird, in Ermangelung einer bestätigenden Analyse mit authentischen Standards, muss vom Analysten sorgfältig durchgeführt werden. Automatisierte Aktionen sind in jeder kommerziellen Software verfügbar; Dazu gehören die Bewertung der spektralen Signaturähnlichkeit der MS anhand der gesammelten Referenzspektren (d. h. Spektralbibliotheken) und die Bewertung der charakteristischen Verhältnisse zwischen Qualifizierer-/Quantifiziererionen. Es sind jedoch zusätzliche Bestätigungskriterien erforderlich, um die Identifizierung von Isomeren zu verdeutlichen. Das Protokoll schlägt die Einführung linearer Aufbewahrungsindizes vor, um die Liste der Kandidaten zu priorisieren; die Grenze bezieht sich hier auf die Verfügbarkeit von Aufbewahrungsdaten und deren Konsistenz.
Das Hauptmerkmal, das diesen Ansatz einzigartig macht, ist die Vorlage, die12,13,15,29entspricht. Der Vorlagenabgleich ermöglicht die 2D-Mustererkennungauf sehr effektive, spezifische und intuitive Weise. Es kann in Bezug auf Sensitivität und Spezifität durch Anwendung benutzerdefinierter Schwellenwerte und / oder Einschränkungsfunktionen festgelegt werden, während der Analyst das Verfahren durch aktive Interaktion mit Transformationsfunktionsparametern überwachen kann. Die Besonderheit dieses Verfahrens beruht auf der Möglichkeit, gezielte und ungezielte Peaks-Informationen zwischen Proben einer einheitlichen Charge, aber auch zwischen Proben, die trotz mittlerer bis schwerer Fehlausrichtung unter den gleichen Nennbedingungen aufgenommen wurden, quer auszurichten. Die Vorteile dieser Operation beziehen sich auf die Möglichkeit, alle gezielten Analytenidentifikationen zu erhalten, was für den Analysten eine zeitaufwändige Aufgabe ist, und alle Metadaten, die für gezielte und ungezielte Peaks aus früheren Ausarbeitungssitzungen gespeichert werden.
Der Vorlagenabgleich ist auch in Bezug auf die Rechenzeit sehr effektiv; MS-Datendateien mit niedriger Auflösung bestehen aus etwa 1-2 GB gepackten Daten, während hochauflösende MS-Analysen 10-15 Gb pro einzelnem Analyselauf erreichen können. Der Vorlagenabgleich verarbeitet nicht jedes Mal die vollständige Datenmatrix, sondern führt zunächst eine Retentionszeitausrichtung zwischen Chromatogrammen unter Verwendung von Vorlagenspitzen durch, verarbeitet dann Kandidatenspitzen innerhalb des Suchfensters für ihre Ähnlichkeitsübereinstimmung mit dem Verweis in der Vorlage. Im Falle einer schweren Fehlausrichtung, der schwierigsten Situation, schnitten globale Polynomtransformationen zweiter Ordnung besser ab als lokale Methoden, während die Rechenzeit reduziert wurde13.
Damit sich die GC×GC-Technik weit über akademische und Forschungslabors hinaus verbreiten kann, müssen Datenverarbeitungswerkzeuge grundlegende Operationen für die Visualisierung und Chromatogramminspektion erleichtern. Die Identifizierung von Analyten sollte die Möglichkeit bieten, standardisierte Algorithmen und Verfahren (z. B. NIST-Suchalgorithmus undI-T-Kalibrierung) zu übernehmen; und die crossvergleichende Analyse sollte intuitiv, effektiv und durch interaktive Tools unterstützt werden. Der vorgeschlagene Ansatz adressiert diese Anforderungen und bietet gleichzeitig erweiterte Optionen und Werkzeuge, um mit komplexen Situationen wie Analyten-Co-Elution, Mehrfachanalytkalibrierung, Gruppentypanalyse und paralleler Detektionsausrichtung umzugehen.
Die referenzierte Literatur deckt viele mögliche Szenarien ab, in denen GC×GC und ganz allgemein eine umfassende zweidimensionale Chromatographie einzigartige Lösungen und zuverlässige Ergebnisse bieten, die mit der 1-D-Chromatographie in der Einzellaufanalyse nicht erreicht werden können. 5,32,33 Obwohl GC×GC das leistungsstärkste Werkzeug ist, das die Trennkapazität und -empfindlichkeit erhöht, gibt es immer Einschränkungen bei der Trennkraft, der Empfindlichkeit und anderen systemischen Kapazitäten. Mit der Annäherung an diese systemischen Grenzen wird die Datenanalyse zunehmend schwieriger. Daher müssen Forschung und Entwicklung die uns zur Verfügung stehenden Analyseinstrumente weiter verbessern.
The authors have nothing to disclose.
Die Forschung wurde von Progetto Ager − Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare unterstützt. Projektakronym Violin – Valorisierung italienischer Olivenprodukte durch innovative Analysewerkzeuge (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto). Die GC Image-Software ist für eine kostenlose Testversion für Leser verfügbar, die das Protokoll demonstrieren und testen möchten.
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |