SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

1. HPLC システムのセットアップ 2つの独立したHPLCポンプ(バイナリポンプ)からなるシステムを設定します。両方のポンプは、それぞれのソフトウェアを搭載したコンピュータを介して、またはマスターポンプを持つことによって一緒に制御する必要があります。両方のポンプに対して、重力を介して、または第3の低圧ポンプを介して、ピストンシール洗浄を実施します。バッファ A (ポンプ A と呼ぶ) に対して 1 つのポンプと、バッファー B (ポンプ B と呼ぶ) に 1 つのポンプを指定します。注:両方とも、60バール(6 MPa)までの圧力と少なくとも0.5 mL /分の流量を生成できる必要があります。 両方のポンプをダイナミックミキサーに接続します。 ミキサーを少なくとも 1 mL の容量のサンプル ループで注入バルブに接続します。 対応する端の継手を介して毛管で列に注入弁を接続します。 適切な長さのキャピラリーを使用して、列を分数コレクターに接続します。注: この記述は、新しい高度なシステムよりも多くの手動手順を必要とする HPLC システム ( 材料表を参照) に基づいています。当社のシステムは、すべてのコンポーネントの簡単なアクセスと変更を可能にします。第四級ポンプ(ここで説明するバイナリ勾配)も使用することができ、溶出プロファイルとバイナリポンプで達成されたものと同様の分析の全体的な品質につながります。 2. バッファー、カラム、HPLC システムの準備 可溶性インスプの抽出用バッファを準備します: 抽出バッファ (1 M HClO4) および中和バッファ (1 M K2CO3).超純度脱イオン水で両方のバッファーを準備します。彼らは数ヶ月間室温で安定しています。抽出の直前に、EDTAを両方の溶液に加え、最終的な濃度3 mM(例えば、250 mM EDTAストック溶液から)を加える。注意:HClO4( 過塩素酸)は強く腐食性である。 SAX-HPLC 実行用のバッファーを準備します: バッファー A (1 mM EDTA) およびバッファー B (1 mM EDTA, 1.3 M (NH4)2HPO4;HH 3.8 と H3PO4)。超純イオン水を使用した後、0.2 μmの細孔サイズの膜フィルターを使用して真空ろ過を行います。これらは数ヶ月間室温で安定しています。注: EDTA は、InsP とのカチオンの相互作用を防ぐためにすべてのバッファーに含める必要があります。 次のようにグラデーションをプログラム: 0\u20122 分、0% バッファー B;2\u20127 分、最大 10% バッファー B。7\u201268 分、最大 84% バッファー B。68\u201282 分、最大 100% バッファ B。82\u2012100 分、100% バッファー B、100\u2012101 分、0% バッファー B まで下げる。101\u2012125 分、0% バッファー B。この勾配の最適な流量は 0.5 mL/min です。 実行中は、分 1 から分 96 まで、毎分分分の分数を収集します。勾配の残りの30分は、カラムとシステムを洗浄するのに役立ち、シンチレーションカウントのために収集する必要はありません。 可能であれば、HPLCポンプの緊急停止前に到達可能な最大圧力を80バール(8 MPa)に設定します。これにより、カラムの樹脂に 重大な損傷を与 えるのを防ぎます。 新しいSAX HPLCカラムを使用する場合は、最初の使用前に濾過された超純イオン化水で十分に洗浄してください(>50 mL)。注:これにより、含まれるメタノールの除去が保証され、後のステップで塩沈殿を防ぐことができます。可能であれば、別のHPLCポンプを使用してください。これが利用できない場合は、カラムを洗浄する前に、HPLCが水で洗い流されていることを確認してください。流量は2 mL/分を超えてはなりません。洗浄後、列は分析の準備が整い、適切に処理された場合は 20\u201240 の実行に使用できます。その後、解像度は連続して減少します。バッファー A (>1 時間) で長時間洗浄し、ステップ 2.6 を実行すると、カラムの寿命を延ばすことができます。解像度の低下が続く場合は、列を交換する必要があります。勾配は、特定のイノシトールポリリン酸種間の分離を増加させるか、または全体的なランタイムを減少させるために調整することができます。異なるHPLCシステム(異なるボイド体積またはキャピラリーの体積が異なる)を使用すると、保持時間に強く影響します。また、列の変更は、保持期間に影響を与えます。 「模擬実行」を実行します。抽出されたサンプルの代わりに、HPLCシステムに濾過された超純粋脱イオン水を注入し、標準の勾配を実行します。分数を収集する必要はありません。注: ステップ 2.6 はオプションです。ただし、次のいずれかの状況に該当する場合は、新しい列がインストールされている場合は実行する必要があります。HPLCシステムは、事前に別の方法のために使用されています。HPLCシステムは3日以上使用されていません。前の実行に問題がありました。 3. 植物栽培とラベリング[3H]-ミオ-イノシトール 注:次の手順は、ラジオラベルでの汚染から手を保護するために手袋を着用しながら、 滅菌部品 と 無菌条件下で実行する必要があります。植物培地は、特にスクロースを含む場合、微生物汚染を起こしやすい。 1 mL の A. タリアナ 種子を 1.2% 次亜塩素酸ナトリウム 3 分間殺菌し、その後 1 mL 70% エタノールを 3 分間殺菌します。その後、100%エタノールの1mLを追加し、エタノールと種子を円形のろ紙にピペットし、クリーンベンチ上の層流下で空気乾燥させます。 L.ジャポニカスシードを使用する場合は、それらをモルタルに入れ、殺菌前にサンドペーパーで種子をスクラブして十分な発芽率を確保します。 半強度の村重とスクーグ(MS)塩溶液、1%のスクロース、0.7%のジェランガムをKOHでpH 5.7に調整し、少なくとも1日4°Cの暗闇の中で層化できるようにして、半強度のムラシゲとスクーグ(MS)塩溶液からなる固体成長培地で満たされた正方形のペトリ料理に1〜2列で シロイナナズナの 種をまき出し、少なくとも1日の階層化を可能にします。 ロータス種子の場合は、脱イオン水で0.8%の細菌学的寒天からなる固体成長培地で満たされた正方形のペトリ皿に1列でそれらをまき出し、暗闇の中で4°Cで少なくとも3日間の層化を可能にします。 成長インキュベーターまたは気候室にプレートを垂直に置き、短い日の条件下で10〜12日間成長させます(22°Cで8 h光、20°Cで16時間暗く)。 10~20本の苗を、1%のスクロースを補った2mLの半強度MS塩溶液で満たされた12ウェルクリアフラットボトムの細胞培養プレートの1つのウェルに移し、pH 5.7に調整します。 45 μCiの[3H]-ミオイノシトール(30~80°C/mmol、90%エタノールに溶かして)を加え、穏やかな渦巻きで混ぜます。プレートに対応する蓋を覆い、マイクロポーラス手術テープ(例えば、マイクロポアまたはロイコポレテープ)で密封し、成長インキュベーターに戻します。注意:[3H]は、吸入、摂取、または素肌を介して吸収されたときに有害な放射線の危険を起こす可能性のある低エネルギーベータエミッタです。放射性物質や放射性物質と直接または間接的に接触する機器を取り扱う場合は、 必ず 手袋を着用してください。また、放射線化学物質の安全な取り扱いのためのローカルルールに従ってください(例えば、追加の保護服を着用し、線量計の使用、定期的に汚染のための表面の調査)。 5日間のラベリングの後、培地から苗を取り除き、脱イオン水で短時間洗います。ペーパータオルで乾燥させ、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。チューブ をオーバーフィルせず 、約10\u201220 17日齢の苗に相当する100mgのFW/チューブを置かないでください。注:植物材料の過剰な抽出プロセス中に酸を希釈し、抽出効率を強く低下させます。 液体窒素でチューブをスナップフリーズし、抽出するまで-80°Cで保存します。注:サンプルの品質を損なうことなく、サンプルを数週間-80 °Cに保つことができます。成長条件(媒体、光、温度、時間)は、特定の実験または植物種のニーズに応じて変更することができる。しかし、定量化可能なSAX-HPLCの良好な品質を確実に行うためには、[3H]-ミオ-イノシトールを希釈する際には注意が必要です。したがって、ここで述べた[3H]-ミオ-イノシトール濃度で始まり、必要に応じて段階的に減らすことが推奨される。標識時には、植物は、グローバルなInsPに対するこれらの条件の影響を評価するために、異なる処理(例えば、環境ストレスや化学薬品)に提出することができます。定常標識に到達するには、プラントに少なくとも 5 日間のラベルを付けることをお勧めします。 4. 可溶性インスプスの抽出 注:抽出プロセス全体の間、サンプルと試薬を氷の上に保管してください。特に研削時には、放射性物質と接触する危険性が高いため、 常に手袋と保護メガネを着用 してください。サンプルと接触するすべてのものは 放射性廃棄物 とみなされ、放射性物質の安全な処分のための地元の規則に従って処分されるべきです。 ステップ 2.1 のように抽出および中和バッファーの作業ソリューションを準備します。各サンプルには600 μLの抽出バッファと400 μLの中和バッファが必要です。バッファーを氷の上に保管します。 サンプルを-80°Cの冷凍庫から採取し、さらに処理するまで液体窒素に保管してください。サンプルをマイクロ遠心分離チューブの害虫で粉砕し、解凍を開始し、500 μLの氷冷抽出バッファーを追加します。サンプルが完全に均質化され、溶液が深い緑色になるまで粉砕を続けます(葉がサンプルに存在する場合)。 ≥18000 x gで4 °Cで10分間サンプルを遠心分離します。上清を1.5mLの新鮮なチューブに移します。抽出に使用されるチューブは、固体放射性廃棄物とみなされ、それに応じて処分する必要があることを覚えておいてください。 300 μLの中和バッファーを抽出物に慎重に加えます。タンパク質の沈殿とバブリングはすぐに開始されます。1分後にピペットチップで旋回して混ぜ、数秒待ってからpH紙に少量(5 μL)をピペット処理します(理想的にはpH6~9の範囲)。pH は最終的に pH 7 と 8 の間にする必要があります。 必要に応じて、目的のpHに達するまで、少量の中和バッファーまたは抽出バッファーを追加します(通常は 10 ~ 20 μL)。サンプルは開いた蓋で少なくとも1時間氷の上に置きます。 遠心分離器は、≥18,000 x gで4 °Cで10分間のサンプルを遠心分離します。上清を1.5mLの新鮮なチューブに移します。注:サンプルは、SAX-HPLCの実行で直接使用するか、氷上で保管するか(同じ日に後で使用する場合)、液体窒素で凍結し、2\u20124週間は-80°Cで保存することができます。再現性と比較性を高く保つため、その後直接使用する場合でも、常に液体窒素で5分間凍結することをお勧めします。抽出されたサンプルの長期保存-80 °Cは、サンプルが一度だけ解凍される限り可能です。凍結サンプルを解析に使用する場合は、解凍後にパーティクルが見 えないように します。それ以外の場合は、再び遠心分離機は≥18,000 x g で4°Cで10分間、新しい1.5 mLチューブに上清を移します。 5. HPLC 実行の実行 分数コレクターに96個の小さなシンチレーションバイアル(〜6mLの容量)を装備し、各バイアルに2mLの適切なシンチレーションカクテル(例えば、Ultima-Flo AP液体シンチレーションカクテル)を低pHおよび高リン酸アンモニウム濃度の緩衝液と互換性のある充填する( 表の材料を参照)。注:バイアルの数とバイアルのサイズは、使用される分数コレクタとシンチレーションカウンターによって異なります。ここで説明した勾配が使用される場合は、 少なくとも最初の90分を収集することが重要であり、完全なイノシトールポリリン酸プロファイルを得る。また、分数やサンプルの混入を防ぐために、すべてのバイアルとそれぞれの蓋に 適切にラベルを付 けることを確認してください。 HPLCシステム/ポンプを起動し、それを実行する準備をします。ピストンシール洗浄を有効にし、全体の走行中に活性化し続けます。適切なシリンジを使用してステップ4.5(約750 μL)から完全な上澄みを手動で注入してサンプルをロードします( 材料表を参照)。自動注入が可能な場合は、対応するサンプルバイアルにサンプルを移します。バルブを「負荷」から「注入」位置に回し、勾配と分数コレクターを開始します。注: 使用する HPLC システムによっては、特に、古いシステム (ここで説明する) を完全にソフトウェア制御の新しいモデルと比較する場合、開始手順が異なる場合があります。勾配、サンプル注入、分数収集が同時に開始されるようにすることは非常に重要です。 HPLCの実行が進行中である間、圧力を定期的に確認してください。開始圧力は18-24バー(1.8-2.4 MPa)前後で、100%バッファBに達すると50-60バール(5~6 MPa)までゆっくりと上昇する必要があります。注意: 圧力の低下はシステムのリークを示し、圧力の増加は閉塞を示す可能性があります。圧力変動(数秒で3バー≥)は、システム内の空気の存在を示すことができます。列を離れるすべてのものだけでなく、インジェクターまたはその後に発生するすべての漏出は 放射性である点に注意してください。注: 圧力は HPLC システムにも依存し、ここで述べたよりも低いまたは高い場合があります。約15~20回の実行後、徐々に増加します。ただし、これは必ずしも得られた実行の品質に影響を与えるわけではありません。 走った後、バイアルをしっかりと閉じ、激しく振ることによってシンチレーションカクテルと分数を混ぜます。測定を直接進めるか、理想的には暗闇の中で、アップライトの位置にバイアルを保ちます。注:シンチレーションカクテルと混合された分数は数週間安定しており、後で測定することができます。トリチウムの半減期は12.32年なので、信号損失はごくわずかです。 その日の最後のサンプルの実行が終了したら、両方のHPLCポンプを停止します。 (オプション)システムの寿命を延ばすため、特に定期的に使用されていない場合は、バッファBのキャピラリーをバッファAのボトルに入れてポンプBと毛細血管を洗浄し、ポンプを10〜15分間稼働させます。次の使用の前に、キャピラリーをバッファBに交換し、ミキサーからポンプBを切り離してバッファBで洗い流すことを 忘れないでください 。ポンプと毛細血管がバッファBで再び満たされたら、ミキサーと再接続して、システムを使用する準備が整いました。 6. 分数の測定 シンチレーションカウンターラックにバイアルを挿入し、液体シンチレーションカウンターで5分間各バイアルを測定します。 理想的には、小さなバイアルに直接収まり、カウントエラーを減らすために大きな(例えば、20 mL)バイアルのバイアルに吊り下げを避けるラックを使用します。このプロトコルで使用されるソフトウェア設定を 補足図 1に示します。注:定期的に、非消しの[3H]規格を使用してSNC(自己正規化とキャリブレーション)プロトコルを実行します。より短いカウント時間(1-5分)は待ち時間を減らすために可能である。ただし、高いカウント再現性と精度を確保するために、5分をお勧めします。 7. データ分析 シンチレーションカウンターから測定値をスプレッドシートファイルまたは互換性のある/変換可能なファイル形式としてエクスポートします。Excelまたは同様のソフトウェアを搭載したコンピュータと、Originのような適切な分析ソフトウェアでデータを評価します。 2-D 折れ線グラフを準備し、測定された分あたりの数 (cpm) が保持時間に対してプロットされます (図 1、図 2を参照)。 サンプルを互いに比較するには、個々のサンプルごとに分 25 から 96 までの各溶出分数から cpm を合計して データを正規化 します。注:ミニッツ25は、分析から非法人[3H]-ミオ-イノシトール、InsP1 およびInsP2 を除外するためのカットオフとして使用され、それらは強く変動する傾向があり、(少なくともこのプロトコルで提案された勾配で)十分に分離することができず、したがって、その高い活性のために正規化因子を強く変化させる。 cpm が最も低い cpm (分数 25\u201296) の最小 cpm を持つサンプルの合計 cpm を他のサンプルの cpm の合計 (分数 25 – 96) で除いて、すべてのデータをサンプルに正規化します。結果の係数を使用して、各分数の cpm を係数で乗算することで、各分数から cpm を正規化することができます。注: 最後に、分 25 から終わりまでの cpm 値の合計は、すべてのサンプルが互いに比較して等しい必要があります。正規化された実行のみが同じグラフ/図で表示されます (実際のプロファイルとして表示される場合)。補足図 2は、これらの計算ステップの例を示しています (単純化のために 2 つのサンプルの分数 25 ~ 35 のみを使用)。ただし、データを正規化する必要がない場合もあります。たとえば、ステップ 7.4 に従ってピークが定量化され、InsP 全体のパーセンテージとして表示される場合 (図 3Dに示すように)。前に述べたように、複数の分析をプロファイルとして並べて提示する場合、または実際の測定された活動が結論に使用される場合(例えば、治療a)は、対照と比較してInsP7をx%増加させ、両方のサンプルのInsP7のcpm値を参照し、合計InsPのパーセンテージに言及する)正規化が必要である。標識効率に対する遺伝子型または治療の違いの影響を分析するには、これらの違いを無効にするため、正規化しないことが重要です。しかし、この方法による絶対定量は、このプロトコルによる抽出効率が様々な理由で変化し、同じ遺伝子型および治療のレプリカが分析される場合にも観察されるため、困難です。分析に使用するHPLCシステム、カラム、勾配によっては、カットオフを変更する必要がある場合があります。 特定のイノシトールポリリン酸ピークの 相対的な定量を実行 し、その後、統計分析のための複製のデータを含む 棒グラフ を作成するには、クロマトグラムのピーク領域(例えば、起源)を計算できる特殊なソフトウェアで分析を継続します。 補足図 3を参照してください。注: ソフトウェア制御の HPLC システムのほとんどは、このタスクが可能なそれぞれのソフトウェアを提供します。ピークは、バックグラウンドの上に cpm 値がある分数 (実行の間に一定の割合に変化) と以前にパブリッシュされたデータと類似した保持時間として決定されます。特定のピークの保持時間は、スプレッドシートソフトウェア(例えば、Excel)で決定され、明確な積分(例えば、原点)の計算のためのピークを割り当てるのに使用されます。 補足図3 は、ピークの決定、背景減算およびピークの統合のこのプロセスを示す。