Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

JoVE Journal > Biochemistry

생화학

Método UPLC-UV aprimorado para quantificação de vitamina C em variedades de alface (Lactuca sativa L.) e Parentes Silvestres de Cultura(Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

Apresentamos um método rápido e confiável para quantificar a vitamina C em Lactuca spp. usando UPLC-UV, potencialmente transferível para outras plantas. Os principais passos são a preparação da amostra e a extração de vitamina C em condições estáveis, a redução do ácido dehidroascórbico ao ácido ascórbico e a otimização do procedimento cromatográfico.

Abstract

Vitaminas, especialmente vitamina C, são micronutrientes importantes encontrados em frutas e vegetais. A vitamina C também é um dos principais contribuintes para sua capacidade antioxidante. A alface é um dos vegetais mais populares entre os consumidores em todo o mundo. Um protocolo preciso para medir o teor de vitamina C na alface e outras espécies relacionadas é crucial. Descrevemos aqui um método utilizando a técnica de cromatografia-ultravioleta líquida de alto desempenho (UPLC-UV), na qual as condições de preparação da amostra, extração de vitaminas e cromatografia foram otimizadas.

Foram coletadas amostras para representar toda a planta, congelada a -80 °C e liofilizada para evitar oxidação indesejável e facilitar sua manipulação. A extração de vitamina C foi realizada em meio ácido, o que também contribuiu para sua estabilidade. Como a vitamina C pode estar presente em duas formas interconversíveis diferentes, ácido ascórbico (AA) e ácido dehidroascórbico (DHAA), ambos os compostos devem ser medidos para quantificação precisa. O DHAA foi quantificado indiretamente após sua redução para AA porque a AA apresenta uma absortividade maior do que a DHAA na faixa UV do espectro. A partir do mesmo extrato, foram realizadas duas medições, uma antes e outra após essa reação de redução. No primeiro caso, estávamos quantificando o conteúdo AA, e no segundo, quantificamos a soma de AA e DHAA (TAA: ácido ascórbico total) na forma de AA. Em seguida, a quantidade DHAA foi obtida indiretamente pela subtração de AA proveniente da primeira medição do TAA. Eles foram determinados pelo UPLC-UV, utilizando um padrão AA comercial para construir uma curva de calibração e otimizando o procedimento cromatográfico, para obter picos AA que foram completamente resolvidos em pouco tempo. Este protocolo pode ser facilmente extrapolado para qualquer outro material vegetal com pequenas ou nenhuma alteração. Sua precisão revelou diferenças estatisticamente significativas de outra forma não concebidas. Outros pontos fortes e limitações são discutidos mais profundamente no manuscrito.

Introduction

Alface cultivada (Lactuca sativa L.) é uma das hortaliças folhosas mais produzidas e consumidas em todo o mundo, com uma produção total de cerca de 27,3 milhões de toneladas em 2018¹. A alface é percebida como saudável pelos consumidores. As propriedades nutricionais são atribuídas principalmente à fonte de compostos antioxidantes na cultura, como a vitamina C, entre outras como polifenóis e vitamina E². A vitamina C é um micronutriente essencial para os seres humanos ao contrário de muitos outros vertebrados, pois somos incapazes de produzi-la devido a mutações presentes na codificação genética para a enzima de última etapa na via biossintética³. É necessário para um metabolismo celular normal e também desempenha um papel importante nas respostas imunológicas principalmente devido à sua atividade antioxidante³^,⁴.

A vitamina C total é composta de ácido ascórbico (AA) e ácido dehidroascórbico (DHAA). AA é a forma mais biologicamente ativa da vitamina, mas a DHAA (seu produto de oxidação) também mostra atividade biológica e pode ser facilmente convertida em AA no corpo humano⁵. Portanto, quantificar ambas as formas é importante para determinar o teor total de vitamina C de qualquer cultura horticultural, incluída na alface.

Uma grande variedade de abordagens baseadas em diferentes técnicas analíticas têm sido utilizadas para medir a vitamina C em vegetais, como métodos enzimáticos, espectrofotométricos e titrimétricos^6,^7,⁸. Embora esses métodos sejam simples, eles não são quimicamente específicos para AA⁹. Consequentemente, os métodos cromatográficos são preferidos, especialmente a técnica de cromatografia líquida-ultravioleta líquida de alto desempenho (HPLC-UV), devido à sua maior precisão¹⁰. O HPLC-UV tem sido usado para determinar a vitamina C em uma grande diversidade de culturas, como brócolis, espinafre e alface^11,^12,¹³. No entanto, a quantificação simultânea de AA e DHAA é complicada devido à baixa absortividade de DHAA na faixa UV do espectro. Alternativamente, o DHAA pode ser determinado indiretamente usando um agente redutor que converte DHAA em AA, medindo ácido ascórbico total (TAA) e, em seguida, calculando a diferença entre TAA e AA. Devido à necessidade de uma reação de redução, em alguns estudos, apenas a AA foi quantificada¹⁴, o que poderia realmente representar uma subestimação da atividade de vitamina C. Essa reação de redução adicional também é necessária para determinar indiretamente o DHAA mesmo quando o último avanço nas técnicas de cromatografia líquida, cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC), é usado. Essa etapa também se beneficia das vantagens que a UPLC apresenta quando comparada ao HPLC: maior eficiência e resolução, maior sensibilidade, análise de menor tempo e menor consumo de solventes¹⁵. Em consequência, a técnica UPLC-UV tem sido utilizada para quantificar a vitamina C em diferentes culturas¹⁶.

Além disso, a AA é uma molécula muito labile; assim, é importante desenvolver um protocolo que previne sua degradação durante o armazenamento de alface e a análise de vitamina C⁹. Neste contexto, o protocolo a seguir oferece uma quantificação rápida e aprimorada do teor de vitamina C na alface pela UPLC-UV, bem como um procedimento de extração eficiente. Não apenas cultivares de elite foram incluídas no presente estudo, mas também corridas terrestres tradicionais e alguns parentes selvagens devido ao seu potencial interesse na criação de culturas, especificamente na melhoria do valor nutricional da alface.

Protocol

1. Preparação do material vegetal Prove pelo menos duas folhas por planta em tubos de polipropileno de 50 mL, um externo (mais antigo) e um interno (mais jovem) a fim de representar com mais precisão toda a planta. Colete pelo menos três réplicas biológicas para cada amostra. Congele-os imediatamente usando nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C até usar. Certifique-se de que o nitrogênio líquido não entre nos tubos; caso contrário, eles poderiam explodir quando removidos devido à expansão do gás durante a vaporização.ATENÇÃO: Luvas e um escudo facial são necessários devido aos perigos potenciais associados ao uso de nitrogênio líquido. Retire as tampas dos tubos e coloque-as nas bandejas dentro da câmara de secador congelante do liofilizador(Tabela de Materiais)programada da seguinte forma: -25 °C para 72 h, -10 °C para 10h, 0 °C por 10 h e 20 °C por pelo menos 4h. Mantenha a temperatura do condensador e a constante de vácuo durante o processo de secagem congelante a -80,2 °C e 112 mTorr, respectivamente. Quando o material estiver completamente seco (entre 4 e 7 dias, dependendo da planta e do grau de compactação no tubo), preserve a 4 °C, -20 °C ou -80 °C para armazenamento curto (dias a semanas), médio (meses) ou longo (anos), respectivamente. Recomenda-se a inclusão de sacos contendo contas de gel de sílica nos tubos contendo amostras. Coloque as amostras liofilizadas em tubos de polipropileno de 20 mL juntamente com bolas de aço inoxidável de 10 mm de diâmetro e triture-as com um vórtice multitube usando a intensidade e o tempo necessários para obter uma poeira fina.NOTA: Durante todo o processo, proteja as amostras da exposição à luz direta. 2. Reagente e preparação de soluções Preparar a solução de extração de solventes: 8% ácido acético (v/v), 1% MPA (ácido metafosfórico) (w/v), 1 mM EDTA (ácido etilenodiaminetetraacético). Calcule o volume total de solvente necessário para processar todo o conjunto de amostras levando em conta que 5 mL serão adicionados a cada um. Para preparar 1 L da solução, adicione a um frasco: 30 g de MPA, 0,372 g de desidratação EDTA, 80 mL de ácido acético e 500 mL de água ultrauso (volumes de escala e quantidades em conformidade). Sele a boca de frasco com filme plástico. Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, use um frasco volumoso para medir com precisão 1 L, adicionando a água ultrapura necessária. Prepare o tampão de reação de redução (0,5 M Tris (2-amino-2-(hidroximetol)-1,3-propanediol) pH 9.0) e solução redutora (40 mM DTT (1,4-Dithiothreitol) com 0,5 M Tris pH 9.0). Calcule o volume total de solução redutor necessária para processar todo o conjunto de amostras levando em conta que 200 μL serão adicionados a cada uma delas. Para preparar 100 mL do tampão, adicione a um béquer: 6,055 g de Tris e 90 mL de água ultrauso (volumes de escala e quantidades em conformidade). Sele a boca de béquer com filme de plástico. Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, ajuste a solução para pH 9.0 adicionando 2 M HCl e use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando a água ultrapura necessária. Para preparar 100 mL da solução redutor, adicione a um béquer: 0,629 g de DTT (pureza: 98%) e 90 mL do buffer (0,5 M Tris pH 9.0) previamente preparado (2.2.1 a 2.2.2). Dimensione volumes e quantidades em conformidade. Sele a boca de béquer com filme de plástico. Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando o volume necessário de tampão 0,5 M Tris pH 9.0.NOTA: A solução redutor é muito instável. É por isso que uma solução recém-feita é fortemente recomendada. Ácido sulfúrico (0,4 M H2SO4) Calcule o volume total de ácido sulfúrico de 0,4 M necessário para processar todo o conjunto de amostras levando em conta que 200 μL serão adicionados a cada um. Para preparar 100 mL da solução, adicione a um béquer: 80 mL de água ultrauso e depois 2,22 mL de H2SO4 (pureza: 96%, densidade: 1,84 g mL-1). Use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando a água ultrapura necessária.ATENÇÃO: O ácido sulfúrico é muito corrosivo, por isso deve ser manuseado usando equipamento de proteção e sob capô. Além disso, o ácido deve ser adicionado à água ultrauso, e não à água para o ácido, para reduzir a fumaça e evitar acidentes. Ácido clorídrico (2 M HCl). Para preparar 100 mL de ácido clorídrico de 2 M, adicione a um béquer: 80 mL de água ultrauso e depois 6,13 mL de HCl (pureza: 37%, densidade: 1,19 g mL-1). Sele a boca de béquer com filme de plástico. Use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando a água ultrapura necessária. Dimensione os volumes de acordo.ATENÇÃO: O ácido clorídrico é muito corrosivo, por isso tem que ser manuseado usando equipamentos de proteção e sob a capa. Além disso, o ácido deve ser adicionado à água ultrauso, e não à água para o ácido, para reduzir a fumaça e evitar acidentes. Padrão AA (estoque e diluições) Pesar exatamente 10 mg de padrão AA (pureza: 99%) utilizando uma balança de precisão e adicionar 90 mL de fase móvel (pH de água ultrauso 2.0 com ácido fórmico). Uma vez dissolvido com a ajuda de um agitador magnético, use um frasco volumoso para medir com precisão 100 mL, adicionando o volume necessário de água ultrauso pH 2.0 com ácido fórmico.NOTA: Proteja esta solução de estoque da exposição à luz. Prepare cinco diluições do estoque do padrão AA para obter uma curva de calibração seguindo as instruções na Tabela 1 e proceda com a etapa 5.2. Padrão [AA] (μg mL-1) Solução AA (100 μg mL-1) (μL) Fase móvel (μL)a 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 um PH de água ultrauso 2.0 acidificado por ácido fórmico. Tabela 1: Protocolo para preparar cinco padrões de AA (ácido ascórbico). São indicados volumes de soluto e solvente para preparar cada uma das diferentes concentrações das normas. 3. Extração de AA e DHAA NOTA: Recomenda-se trabalhar em condições de baixa intensidade de luz durante as etapas de extração. Para um tubo de centrífugo de polipropileno de 15 mL, adicione 50 mg de amostra moída liofilizada e 5 mL do solvente de extração (etapa 2.1). Agite a mistura usando um vórtice para 5 s e, em seguida, um agitador orbital por 10 min a 2000 rpm. Introduza o tubo em um banho ultrassônico por 10 minutos à temperatura ambiente com ultrassom ativado. Centrifugar a 4.000 x g por 10 min a 4 °C. Pegue o supernasce, passe por um filtro de celulose regenerado de 0,22 μm e armazene-o em um frasco âmbar de 5 mL. Este é o Extrato 1, que contém AA e DHAA.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui congelando os extratos a -80 °C e protegendo-os da exposição à luz como AA e DHAA são muito instáveis e degradam-se facilmente na presença de luz, em altas temperaturas ou em atmosferas oxidantes(Arquivo Suplementar 1). 4. Redução de DHAA para AA para extrair TAA Transfira 200 μL do Extrato 1 para um frasco âmbar de 2 mL para cromatografia líquida e adicione 200 μL da solução redutora (etapa 2.2). Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e agite-o com um vórtice para 5 s. Deixe a solução ficar por 30 minutos à temperatura ambiente e proteger da luz. Adicione 200 μL de 0,4 M H2SO4 para parar a reação e estabilizar a AA em pH ácido. A solução resultante é o Extrato 2, que contém apenas AA e é na verdade TAA. 5. Determinação Preparação UPLC-UV Prepare as soluções de trabalho descritas na Tabela 2, devidamente filtradas através de filtros de 0,22 μm, sonicadas por pelo menos 10 minutos e coloque-as no sistema UPLC. Ligue os três módulos UPLC e aguarde o término do processo de calibração interna. Abra o software (por exemplo, Empower 3) e carregue o programa instrumental descrito na Tabela 2: Empower 3 | Executar amostras | Método de vitamina C | UPLC_PDA | Use QuickStart. Uma vez que o software esteja carregado com o programa correto, acesse o console de gerenciamento UPLC: Quaternary Solvent Manager | Clique no botão direito do mouse | Console de lançamento. Proceda à preparação e estabilização do instrumento UPLC: Sistema | Controle | Startup. Purgue todas as linhas UPLC por pelo menos 5 min: Prime Solventes | QSM | Verificar A, B, C, D e Lacre | Duração do prime > 5 min. Purgue e limpe o injetor: Prime Solventes | SM | Verifique o solvente Wash (> 45 s) e verifique o solvente do Purpuro (> 35 ciclos). Equilibre UPLC às condições do método: Equilibre-se ao Método | QSM | Fluxo (0,3 mL min-1) | Solvente A (2%) | Solvente B (0%) | Solvente C (98%) | Solvente D (0%); Equilíbrio ao Método | SM | Amostra (5 °C) | Coluna (30 °C) e Equilibre ao Método | Outros | Verifique a lâmpada acesa | Pressione Start. Aguarde pelo menos 1h (ainda mais tempo é recomendado) para que o equipamento se estabilize. Estabilidade pode ser verificada verificando a pressão na coluna no Console de Lançamento: Sistema | Gerente de Solventes Quaternário | Pressão do sistema QSM. Certifique-se de que não há tendências identificáveis em mudanças de pressão (ou aumenta ou diminui) e o valor delta é inferior a 10 psi. Na tela QuickStart, preencha a matriz com os nomes dos padrões e amostras a serem analisados. Determinação AA nas normas Transfira 1 mL de cada uma das cinco normas AA previamente preparadas (etapa 2.5.3) para frascos âmbar de 2 mL para cromatografia líquida. Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e injete 5 μL no instrumento UPLC. Realize a cromatografia seguindo o procedimento descrito na Tabela 2, começando da maioria diluída para a mais concentrada. Determinação AA nas amostras Pipeta 200 μL de Extrato 1 em um frasco âmbar de 2 mL para cromatografia líquida e adicionar 800 μL de água ultrauso. Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e injete 5 μL no instrumento UPLC. Realizar a cromatografia seguindo o procedimento descrito na Tabela 2. Determinação do TAA nas amostras Adicione 400 μL de água ultrauso ao Extrato 2. Feche o frasco com um plugue PTFE-silicone com pré-abertura e injete 5 μL no instrumento UPLC. Realizar a cromatografia seguindo o procedimento descrito na Tabela 2. Componentes e parâmetros Descrição Instrumento Absolvição UPLC Classe H Detector PDA eλλ Detector λabs para AA=245 nm Software Empoderamento 3 Coluna Absolvição UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) Canal A CH3OH Canal B/Lavagem H2O:CH3OH (50:50 v:v) Canal C PH de água ultrauso 2.0 acidificado por ácido fórmicoa Lavagem do Canal D/Seal Água ultrauso:acetonitrilo (90:10 v:v) Fase móvel 0,3 mL min-1 de 2%A + 98%C (modo isocrático) Temperatura da coluna 30 °C Temperatura do autosampler 5 °C Volume de injeção 5 μL Tempo de retenção de AA 1.874 min. Tempo de execução 3 min. um Volume indeterminado de ácido fórmico usado até ajuste de pH Tabela 2: Procedimento cromatográfico otimizado para determinar AA (ácido ascórbico) em extratos de alface e parentes selvagens. Descrição dos componentes, condições e soluções empregadas. 6. Quantificação de AA e DHAA Análise estatística Determinar os parâmetros analíticos do método cromatográfico descrito por Bertolín et al.18 (Tabela 3).NOTA: Os valores dos parâmetros apresentados na Tabela 3 deverão ser definidos em condições experimentais específicas. Parâmetros analíticos do método Valores Faixa linear (μg mL-1) 0.5-25 Equação linear y=53.143,03x R2 0.99998 Limite de detecção (mg AA g-1 de matéria seca) 0.013 Limite de quantificação (mg AA g-1 de matéria seca) 0.045 Repetibilidade (CV, %)a 1.75 Precisão intermediária (CV, %)a 4.22 Recuperação (Rec, %)b 95,6±2,4 um CV: coeficiente de variação b O ensaio de recuperação foi realizado com 10 alíquotas contendo 50 mg da mesma amostra, 5 cravadas com 2 mg de AA g-1 de matéria seca e 5 não-cravadas. %Rec=([AA]amostra-[AA])/([AA]spiked)x100. Tabela 3: Parâmetros analíticos otimizados para detecção e quantificação de AA (ácido ascórbico) e TAA (ácido ascórbico total). A faixa linear, a equação e o coeficiente de determinação da curva de calibração (R2),bem como os limites de detecção e quantificação de AA (o mesmo para TAA), e a repetibilidade, precisão intermediária e recuperação foram obtidos com um volume de injeção amostral de 5 μL. Calcule a concentração de AA e TAA. Abra o padrão e prove cromatgramas: QuickStart | Projeto Browse | Canais | “nome do padrão ou amostra” | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm. Integre o pico correspondente (AA ou TAA) nos padrões e amostras clicando em seu ponto de partida (aproximadamente 1.790 min) e arrastando-o com o mouse até seu ponto final (aproximadamente 1.910 min). Construa uma curva de calibração representando os valores de absorção determinados cromatograficamente (etapa 5.2.) contra a concentração das cinco normas AA elaboradas acima(Tabela 1). Interpolar os valores de absorção das amostras determinados nas etapas 5.3 e 5.4 e obter a concentração de AA e TAA, respectivamente, com a seguinte fórmula:onde y é a área de pico integrada, x é a concentração de AA ou TAA em ppm e m e n são a inclinação e a y-interceptaçãoda linha de regressão obtida, respectivamente. Para calcular a concentração de DHAA, aplique a seguinte fórmula:NOTA: Para obter as concentrações totais do DHAA, AA e TAA em mg g-1 de peso seco, os valores obtidos diretamente interpolados na curva de calibração terão de ser multiplicados pelo volume total do extrato e pelo fator de diluição aplicado, e depois divididos pelo peso da amostra utilizada para a realização da extração.

Representative Results

A quantificação de vitamina C nas matrizes de Lactuca requer o desenvolvimento de uma abordagem cromatográfica que possa garantir resultados confiáveis. A Figura 1A mostra um cromatógrafo resultante de um protocolo não otimizado(Arquivo Suplementar 2),que apresenta um pico AA juntamente com um pequeno “ombro” não identificado. No entanto, após a melhoria das condições de extração e cromatográficas, foi alcançado um pico AA resolvido sem interferências de compostos desconhecidos(Figura 1B). Além disso, o uso de equipamentos UPLC-UV em vez de HPLC-UV nos permitiu reduzir o tempo de retenção (RT) para AA: 1.874 min nos cromatgramas otimizados versus 2.980 min nos não otimizados(Figura 1),bem como os tempos de execução, 3 e 7 minutos para os protocolos otimizados e não otimizados, respectivamente. Figura 1: Cromogramas de AA na mesma amostra de alface (cultivar comercial ‘Begoña’). (A) Cromatografia HPLC-UV resultante de um protocolo não otimizado (condições descritas no Arquivo Suplementar 2). (B) CROmatograma UPLC-UV obtido com o protocolo otimizado (condições descritas na Tabela 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Interferências nos picos de AA, como as observadas na Figura 1A,resultaram consistentemente na subestimação do teor de vitamina C (AA, DHAA e TAA)(Figura 2)devido a uma separação insuficiente durante o processo cromatográfico, pois as áreas de pico sobrepostas foram integradas por uma queda vertical no ponto mais profundo entre eles. Esse viés é especialmente perceptível no caso dos parentes silvestres da cultura, particularmente no teor dhaa e TAA(Figura 2). Figura 2: Distribuição do conteúdo de vitamina C. Parcelas de violino divididas de conteúdo DHAA, AA e TAA (mg g-1 de peso seco) em variedades comerciais e tradicionais de alface e alguns parentes selvagens usando protocolos não otimizados e otimizados. Linhas pretas mostram os valores médios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Além disso, o uso de um protocolo não otimizado nos impediu de extrair qualquer conclusão útil dos resultados, pois eles mostraram todas as amostras, tanto tipos de alface quanto os parentes selvagens, com conteúdo semelhante de vitamina C. Em contrapartida, o protocolo otimizado permitiu detectar diferenças estatisticamente significativas entre eles para o conteúdo DHAA e TAA(Tabela 4),sendo os mais ricos as espécies silvestres(Figura 2). Não otimizado Otimizado F-ratio p-valor F-ratio p-valor DHAA 0.460 0,637ns 5.613 0.009** Aa 0.070 0,932ns 1.020 0,374ns Taa 0.015 0,985ns 4.438 0.022* ns, * e ** indicam não significativo e significativo em p<0,05 e 0,01, respectivamente. Tabela 4: Variação no teor de vitamina C. F-ratios (quocientes de duas variâncias, a variância entre grupos e a variância dentro do grupo) e valores de significância da ANOVA unidirecional considerando o tipo de Lactuca (variedades comerciais de alface, variedades tradicionais de alface e parentes selvagens de cultura) para o teor de DHAA, AA e TAA em protocolos não otimizados e otimizados. Arquivo suplementar 1: Estabilidade AA e TAA a 5 °C acima de 24 h. (A) Áreas de pico AA e TAA ao longo de 24 h. (B) Conteúdo AA e TAA (mg g-1 de peso seco) ao longo de 24 horas. As barras representam os desvios padrão de duas réplicas técnicas (n=2) mantidas no autosampler a 5 °C e protegidas da exposição à luz. Clique aqui para baixar este arquivo. Arquivo Suplementar 2: Principais diferenças entre o protocolo otimizado e o não otimizado para extração e quantificação de TAA, AA e DHAA. As amostras utilizadas foram as mesmas em ambos os casos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A vitamina C é um nutriente muito importante, mas é um composto muito labile também, por isso sua quantificação UPLC-UV depende de múltiplos fatores, como armazenamento e preparação de amostras, método de extração e condições cromatográficas. Por isso, foi necessário um procedimento rápido e simples para evitar a oxidação de AA (com poder antioxidante) para DHAA (sem propriedades antioxidantes). Também foi crucial evitar altas condições de pH e temperatura, bem como luz intensa e atmosfera oxidante durante o tratamento amostral para promover a estabilidade do composto.

Para minimizar a oxidação de AA, foram tomadas as seguintes medidas. Em primeiro lugar, as amostras foram liofilizadas como material inicial para ambos os protocolos para garantir a quantificação precisa do conteúdo de vitamina C e manipular facilmente amostras. Essa opção foi preferida em vez de moagem fina, comumente encontrada ao longo da literatura^19,à medida que a poeira descongela muito rapidamente para que a água volte a ficar disponível. Durante o procedimento de extração, foi utilizado um maior volume de uma solução mais ácida (8% de ácido acético e 1% mpa) como extrator no protocolo otimizado(Arquivo Suplementar 2),que também atuou como estabilizador, impedindo a degradação da AA. Esta solução também continha o EDTA como um agente quelaante para aumentar a estabilização¹⁶, ao contrário do extrator no protocolo não otimizado (Arquivo Suplementar 2). Além disso, testamos se o procedimento de extração poderia ser aprimorado usando duas extrações consecutivas com 2,5 mL de extrator em vez de uma única com 5 mL e sob uma atmosfera N₂ em vez das condições atmosféricas padrão. Os melhores resultados foram alcançados utilizando-se apenas uma extração em uma atmosfera não modificada, o que simplificou o protocolo, fazendo etapas adicionais desnecessárias (dados não mostrados). Outras pequenas alterações também foram introduzidas no protocolo, a fim de melhorar a extração (ou seja, sônica), obter um extrato mais claro (filtração mais fina) e reduzir a duração do protocolo(Arquivo Suplementar 2). Quanto às condições cromatográficas, a validação do método foi realizada conforme relatado antes^{do dia 18}, garantindo bons parâmetros analíticos(Tabela 3). Além disso, o uso de água ultrauso com ácido fórmico (pH 2.0) e metanol (98:2 v:v) com um fluxo de 0,3 mL min^-1, em vez de fosfato monopotássio 30 mM (pH 3.0) a 1 mL min^-1 como fase móvel(Arquivo Suplementar 2),resultou em um método melhorado. O avanço mais importante foi provavelmente usar um sistema UPLC em vez de um HPLC, o que nos permitiu maior controle das condições de impacto (como a temperatura) e resultando em picos AA resolvidos sem interferências por compostos desconhecidos, em um menor tempo e consumindo menos volume de extrato(Arquivo Suplementar 2).

No entanto, existem duas limitações principais desse método. A primeira é que o DHAA não pode ser medido diretamente usando um detector UV devido à sua baixa absortividade na faixa UV do espectro. É importante quantificar o conteúdo DHAA porque apresenta determinada atividade biológica e é facilmente conversível para AA no corpo humano⁵. Para isso, é necessária uma reação adicional para reduzir o DHAA para AA, juntamente com uma segunda execução cromatográfica para medir o TAA e, em seguida, determinar indiretamente o DHAA subtraindo o conteúdo AA do TAA(Figura 3). Nesse sentido, a etapa de redução foi otimizada utilizando-se uma maior concentração do agente redutor (DTT), aumentando o tempo de reação de 5 para 30 minutos, e interrompendo a reação com ácido sulfúrico(Arquivo Suplementar 2). A baixa estabilidade do AA constitui a segunda limitação do método. À medida que o AA começa a degradar 4h após a extração(Arquivo Suplementar 1), é necessário quantificá-lo neste intervalo de tempo. Assim, o número de amostras para extrair é condicionado pelo procedimento cromatógrafo. É por isso que propomos congelá-los nessa etapa deste protocolo, embora, nesse caso, nem todos eles possam ser colocados no autosampler uplc a ser medido automaticamente. Felizmente, o RT reduzido para AA nos permitiu obter cromatogramas de 3 min, muito mais curtos do que os cromogramas de 7 min obtidos usando HPLC (Arquivo Suplementar 2). Assim, o teor de vitamina C poderia ser determinado em um alto número de amostras em uma janela de 4h.

Figura 3: Fluxo de trabalho da quantificação da vitamina C na alface e alguns parentes selvagens.
Diagrama esquemático do protocolo otimizado mostrando dois ramos para a determinação de apenas AA ou AA + DHAA (TAA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como a vitamina C é um nutriente essencial para os seres humanos e devido aos seus importantes benefícios para a saúde, tornou-se objeto de muitos estudos. Portanto, foi quantificado em uma grande variedade de culturas, incluindo alface, um dos vegetais mais consumidos em todo o mundo. Métodos clássicos simples têm sido gradualmente substituídos por técnicas de cromatografia líquida, pois são mais específicos e precisos¹⁰. No entanto, devido à necessidade de uma reação adicional para quantificar ambos, AA e DHAA via HPLC, em alguns estudos sobre alface, apenas AA¹⁴ ou apenas TAA¹¹ (sem quantificar AA antes da redução do DHAA para AA) foram medidos. Além disso, apenas alguns autores quantificaram AA e DHAA, apesar da contribuição de ambas as moléculas para a atividade antioxidante de vitamina C². No entanto, a técnica UPLC tornou-se mais importante nos últimos tempos devido ao seu maior desempenho ao medir a vitamina C em várias culturas¹⁶. Comparando os resultados obtidos neste estudo com as duas metodologias, UPLC e HPLC, essas vantagens foram confirmadas: picos de AA bem definidos graças a uma sensibilidade maior, e em tempos muito curtos, foram alcançados, o que também implica menos recursos consumidos. Apesar da eficiência da UPLC, apenas Chen et al.²⁰ aplicaram essa técnica para medir o teor de vitamina C na alface, o que ainda levou a uma subestimação, pois apenas a forma AA foi quantificada.

Em resumo, este trabalho representa a primeira tentativa bem sucedida de determinar o teor total de vitamina C não apenas em diferentes variedades de alface, mas também em alguns de seus parentes selvagens. A quantificação da vitamina C também é essencial para selecionar alface com maior atividade antioxidante dentro de programas de reprodução. Nesse sentido, o aumento do teor total de vitamina C em parentes selvagens de alface encontrado aqui e o aumento do teor de AA relatado em estudos anteriores¹⁴, bem como outros compostos antioxidantes²¹, amplia os candidatos adequados para melhorar o valor nutricional das alface.

Em conclusão, mesmo com algumas limitações inerentes à natureza da vitamina C, como sua degradação gradual poucas horas após ser extraída ou a necessidade de uma reação de redução devido à baixa absortividade dhaa UV, oferece um método menos intenso e menos demorado para medir o conteúdo de vitamina C. Além disso, também é muito robusto e mostra alta sensibilidade e poder de resolução. Além disso, é facilmente transferível não apenas para outros materiais vegetais com pequenas ou nenhuma mudança, mas também para produtos processados que fornecem a ingestão dietética de vitamina C para humanos, o que dá origem a uma ampla gama de aplicações futuras no campo emergente de testes para qualidade alimentar confiável.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Banco de Germoplasma Vegetal de Zaragoza (BGHZ-CITA, Espanha) e o Centro de Recursos Genéticos (GNV, Wageningen, Holanda) por fornecer as sementes necessárias para este trabalho. Agradecemos a J. A. Aranjuelo, A. Castellanos e “laboratorio de valoración nutritiva” da CITA pelo suporte técnico e D. L. Goodchild por revisar a língua inglesa. Este trabalho foi financiado pelos projetos RTA2017-00093-00-00-00 do Instituto Nacional de Pesquisa e Tecnologia Agropecuária e Alimentícia (INIA) e LMP164_18 do Governo de Aragão; e pelo Programa Operacional FEDER Aragón 2014-2020 e pelo Fundo Social Europeu da União Europeia [Grupos Consolidados A12-17R: “Grupo de investigação en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica” e A14-17R: “Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles” (SAGAS)]. I.M.L. foi apoiado por um contrato pré-doutorado para formação de médicos do Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha (MCIU) e da Agência estatal espanhola de Pesquisa (AEI).

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

References

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Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).