Neisseria meningitidis זיהום של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים שמקורם בתאי אנדותל במוח
Summary
הפרוטוקול המתואר כאן מדגיש את השלבים העיקריים בהתמיינות תאי אנדותל דמויי מוח המושרים פלוריפוטנטים, הכנת Neisseria meningitidis לזיהום, ואיסוף דגימות לניתוחים מולקולריים אחרים.
Abstract
דלקת קרום המוח מנינגוקוק היא זיהום מסכן חיים המתרחש כאשר Neisseria meningitidis (מנינגוקוק, Nm) יכול לקבל גישה למערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי חדירה לתאי אנדותל מוח מיוחדים מאוד (BECs). מכיוון ש-Nm הוא פתוגן ספציפי לאדם, המחסור במערכות מודל in vivo חזקות הופך את המחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן בין Nm ל-BECs למאתגר ומבסס את הצורך במודל מבוסס אדם המחקה BECs מקוריים. לתאי BEC יש תכונות מחסום הדוקות יותר בהשוואה לתאי אנדותל היקפיים המאופיינים בצמתים הדוקים מורכבים ובהתנגדות חשמלית טרנס-אנדותל מוגברת (TEER). עם זאת, מודלים רבים במבחנה , כגון BECs ראשוניים ו- BECs מונצחים, חסרים או מאבדים במהירות את תכונות המחסום שלהם לאחר הסרת המיקרו-סביבה העצבית הטבעית. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות תאי גזע אנושיים פיתחה שיטות להפקת תאי אנדותל דמויי מוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) המשפרים את הפנוקופיה, בהשוואה למודלים אנושיים אחרים במבחנה . לשימוש ב-BECs שמקורם ב-iPSC (iPSC-BECs) כדי למדל אינטראקציה של Nm-BEC יש יתרון בשימוש בתאים אנושיים בעלי תכונות מחסום BEC, וניתן להשתמש בהם כדי לבחון הרס מחסומים, הפעלה חיסונית מולדת ואינטראקציה חיידקית. כאן אנו מדגימים כיצד להפיק iPSC-BECs מ- iPSCs בנוסף להכנת חיידקים, זיהום ואיסוף דגימות לניתוח.
Introduction
מחסום הדם-מוח (BBB), ומחסום הדם-CSF של קרום המוח (mBCSFB) הם מחסומים תאיים הדוקים ביותר המפרידים בין זרימת הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS) ומורכבים בעיקר מתאי אנדותל מוח מיוחדים מאוד (BECs)1,2. יחד, BECs שומרים על הומאוסטזיס תקין במוח על ידי ויסות חומרי מזון ומוצרי פסולת בתוך המוח ומחוצה לו, תוך הרחקת רעלים, תרופות ופתוגנים רבים 1,2. דלקת קרום המוח חיידקית מתרחשת כאשר חיידקים הנישאים בדם מסוגלים לתקשר עם המחסום שנוצר על ידי BECs ולחדור אותו, ולגרום לדלקת. Neisseria meningitidis (Nm, מנינגוקוק) הוא חיידק גראם-שלילי המאכלס את הנסופריינקס של 10\u201240% מהאנשים הבריאים, אך במקרים מסוימים עלול לגרום למחלה מערכתית קשה3. אצל אנשים מושפעים, Nm יכול לקבל גישה לזרם הדם, שם הוא יכול לגרום purpura fulminans, כמו גם לחדור BECs מקבל גישה CNS גרימת דלקת קרום המוח3. Nm הוא גורם מוביל לדלקת קרום המוח חיידקית ברחבי העולם, ולמרות מאמצי החיסון, הוא עדיין הגורם העיקרי לדלקת קרום המוח4. התערבות רפואית מודרנית, כגון טיפול אנטיביוטי, הפכה מצבים אלה לשרידות, אולם אלה שנפגעו מדלקת קרום המוח נותרים לעתים קרובות עם נזק נוירולוגי קבוע 5,6.
מחקרים קודמים זיהו גורמים חיידקיים ואיתות מארח התורמים לאינטראקציות Nm-BEC 7,8,9,10,11. הדבקים והפולשים שזוהו כגון חלבון האטימות Opc, ו- Type-IV pili, כמו גם קולטנים כגון CD147, נערכו על מודלים שונים של BEC במבחנה, אולם מודלים אלה חסרים תכונות BBB מוגדרות רבות 7,9,11,12. הבנה מלאה של אינטראקציות Nm-BEC נותרה חמקמקה, בין היתר בשל חוסר היכולת להשתמש במודלים in vivo, הגנה חלקית מפני חיסונים והיעדר מודלים חזקים של BEC אנושיים במבחנה.
מידול hBECs במבחנה היה מאתגר בשל התכונות הייחודיות של BECs. בהשוואה לתאי אנדותל היקפיים, לתאי BEC יש מספר פנוטיפים המשפרים את תכונות המחסום שלהם, כגון התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל גבוהה (TEER) עקב צמתים הדוקים מורכבים12. לאחר שהוסרו מהמיקרו-סביבה במוח, BECs מאבדים במהירות את תכונות המחסום שלהם, מה שמגביל את התועלת של מודלים ראשוניים או מונצחים במבחנה שיוצרים רק מחסום חלש12,13. השילוב של הספציפיות האנושית של זיהומי ננומטר, היעדר מודלים חזקים in vivo ואתגרים במידול BECs אנושיים במבחנה יוצר צורך במודלים טובים יותר כדי להבין את האינטראקציה המורכבת בין ננומטר לפתוגן בין ננומטר ל-BEC. לאחרונה נעשה שימוש בטכנולוגיות מודל של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC), תאים דמויי BEC הופקו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) המחקים טוב יותר BECs in vivo12,13,14,15. iPSC-BECs הם ממקור אנושי, ניתנים להרחבה בקלות, ובעלי פנוטיפים צפויים של BEC בהשוואה לעמיתיהם העיקריים או המונצחים 12,13,14,15. בנוסף, אנו ואחרים הוכחנו כי iPSC-BECs שימושיים למידול מחלות שונות של מערכת העצבים המרכזית, כגון אינטראקציה בין פונדקאי לפתוגן, מחלת הנטינגטון ומחסור ב-MCT8 הגורם לתסמונת אלן-הורנדון-דאדלי 16,17,18,19,20,21. במאמר זה אנו מדגימים כיצד להפיק iPSC-BECs ממקורות מתחדשים של iPSC וזיהום של iPSC-BECs בננומטר, מה שמוביל להפעלת התגובה החיסונית המולדת. אנו מאמינים כי מודל זה שימושי לחקירת אינטראקציה בין פונדקאי לפתוגן שאינה ניתנת לשחזור במודלים אחרים במבחנה, והוא שימושי במיוחד כאשר בוחנים אינטראקציות עם פתוגנים ספציפיים לבני אדם כגון ננומטר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מידול BECs ו- BBB נתקל באתגרים, שכן BECs אנושיים ראשוניים ומונצחים, במבחנה, נוטים להיות חסרי פנוטיפים מחסום חזקים. הופעתן של טכנולוגיות תאי גזע אנושיים אפשרה יצירת תאים דמויי BEC שמקורם ב- iPSC השומרים על פנוטיפים BBB בולטים צפויים כגון סמני אנדותל, ביטוי צומת הדוק, תכונות מחסום, תגובה לסוגי תאי CN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.M.E. נתמך על ידי תוכנית ההכשרה למחקר DFG GRK2157 שכותרתה “מודלים תלת-ממדיים של רקמות לחקר זיהומים מיקרוביאליים על ידי פתוגנים אנושיים” שהוענקה ל- A. S-U. B.J.K. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של קרן אלכסנדר פון הומבולדט. בנוסף, אנו מודים ללנה וולטר על עזרתה הטכנית ביצירת iPSC-BECs בתרבות.
Materials
| Accutase (1x) | Sigma | A6964 | Enzymatic cell dissociation reagent |
| Acetic acid | Sigma | A6283 | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | Thermo Scientific (Labvision) | RB-10333 | |
| Anti-Claudin-5 | Invitrogen | 4C3C2 | |
| Anti-Glut-1 | Thermo Scientific (Labvision) | SPM498 (MA5-11315) | |
| Anti-Occludin | Invitrogen | 33-1500 | |
| Anti-VE-cadherin | Santa Cruz | sc-52751 | |
| Anti-ZO-1 | Invitrogen | 33-9100 | |
| Bacto Proteose Peptone | BD | 211684 | |
| b-Mercaptoethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 805740 | |
| Cell culture plates and flasks | Sarstedt | ||
| Centrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) | Thermo Scientific | ||
| Class II biosafety cabinet | Nuaire | NU-437-400E | |
| CO2 Incubator (DHD Autoflow CO2 Air-Jacketed Incubator) | Nuaire | ||
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Columbia ager + 5 % sheep blood | Biomerieux | 43049 | |
| Costar Transwell polyester filters (12- or 24-well) | Corning | 3460, 3470 | |
| D(+)-Glucose | Merck (Sigma-Aldrich) | G8270 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | |
| DMSO | ROTH | A994.1 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Epithelial Volt-Ohm Meter (Millicell ERS-2) with STX electrode | Merck (Millipore) | MERS00002 | |
| Fe(NO3)3 | ROTH | 5632.1 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Fluoresence microscope (Eclipse Ti) | Nikon | ||
| Hemacytometer (Neubauer) | A. Hartenstein | ZK06 | |
| Human basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | |
| Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Gibco | 11111-044 | |
| Inverted microscope (Wilovert) | Hund (Will Wetzlar) | ||
| iPS(IMR90)-4 cells | WiCell | ||
| Kellogg's supplement | To prepare 110 ml of Kellogg's supplement, prepare 100 ml of 4 g/ml glucose, 0.1 g/ml glutamine, and 0.2 mg/ml thiamine pyrophosphate and 10 ml of 5 mg/ml Fe(NO3)3 and combine the solutions. Filter sterilize and store aliquoted at -20 °C. | ||
| Knockout serum replacement (KOSR) | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Invitrogen | 35050-038 | |
| LunaScript RT SuperMix Kit | NEB | E3010L | cDNA synthesis kit |
| Matrigel Matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | ROTH | 4627.5 | |
| MgCl2 | ROTH | KK36.1 | |
| Micropipettes (Research Plus) | Eppendorf | ||
| NaHCO3 | ROTH | 6329 | |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| NucleoSpin RNA isolation kit | Machery-Nagel | 740955 | RNA isolation kit |
| Pipette boy (Accu-Jet Pro) | Brand | ||
| Platelet poor plasma-derived serum, bovine (PDS) | Fisher | 50-443-029 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25742 | qPCR master mix |
| qPCR film (MicroAmp Optical Adhesive Film) | Applied Biosystems | 4211971 | |
| qPCR plates (MicroAmp Fast 96-well) | Applied Biosystems | 4346907 | |
| ROCK inhibitor, Y27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | |
| RT-PCR thermo cycler (StepOnePlus) | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Serological pipettes | Sarstedt | ||
| StemFlex basal medium + 50x StemFlex supplement | Gibco | A3349401 | Stem-cell maintenance medium |
| Swinging Bucket Rotor (Heraeus #2704) | Thermo Scientific | ||
| Thiamine pyrophosphate | Sigma | C8754-5G | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 | Non-enzymatic cell dissociation reagent (EDTA) |
References
- Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Rouphael, N. G., Stephens, D. S. Neisseria meningitidis: Biology, microbiology, and epidemiology. Methods in Molecular Biology. , (2012).
- Stephens, D. S., Greenwood, B., Brandtzaeg, P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and Neisseria meningitidis. Lancet. 369 (9580), 2196-2210 (2007).
- Le Guennec, L., Coureuil, M., Nassif, X., Bourdoulous, S. Strategies used by bacterial pathogens to cross the blood-brain barrier. Cellular Microbiology. , (2020).
- Doran, K. S., et al. Host-pathogen interactions in bacterial meningitis. Acta Neuropathologica. 131 (2), 185-209 (2016).
- Cunha, C. S. E., Griffiths, N. J., Virji, M. Neisseria meningitidis opc invasin binds to the sulphated tyrosines of activated vitronectin to attach to and invade human brain endothelial cells. PLoS Pathogens. , (2010).
- Coureuil, M., et al. Meningococcus hijacks a β2-adrenoceptor/β-arrestin pathway to cross brain microvasculature endothelium. Cell. 143 (7), 1149-1160 (2010).
- Bernard, S. C., et al. Pathogenic Neisseria meningitidis utilizes CD147 for vascular colonization. Nature Medicine. 20 (7), 725-731 (2014).
- Slanina, H., Hebling, S., Hauck, C. R., Schubert-Unkmeir, A. Cell invasion by neisseria meningitidis requires a functional interplay between the focal adhesion kinase, Src and cortactin. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
- Unkmeir, A., et al. Fibronectin mediates Opc-dependent internalization of Neisseria meningitidis in human brain microvascular endothelial cells. Molecular Microbiology. 46 (4), 933-946 (2002).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2015).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Hollmann, E. K., Bailey, A. K., Potharazu, A. V., Neely, M. D., Bowman, A. B., Lippmann, E. S. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2017).
- Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. , (2017).
- Kim, B. J., et al. Streptococcus agalactiae disrupts P-glycoprotein function in brain endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 26 (2019).
- Kim, B. J., Shusta, E. V., Doran, K. S. Past and Current Perspectives in Modeling Bacteria and Blood–Brain Barrier Interactions. Frontiers in Microbiology. , (2019).
- Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. , (2019).
- Vatine, G. D., et al. Modeling Psychomotor Retardation using iPSCs from MCT8-Deficient Patients Indicates a Prominent Role for the Blood-Brain Barrier. Cell Stem Cell. , (2016).
- Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Stebbins, M. J., Wilson, H. K., Canfield, S. G., Qian, T., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).
- Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. , (2015).
- Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of brain endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells is enhanced by rho-associated coiled coil-containing kinase inhibition. Tissue Engineering – Part C: Methods. , (2016).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. , (2017).
- Sances, S., et al. Human iPSC-Derived Endothelial Cells and Microengineered Organ-Chip Enhance Neuronal Development. Stem Cell Reports. , (2018).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. , (2017).
- Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. , (2012).
- Schubert-Unkmeir, A., Sokolova, O., Panzner, U., Eigenthaler, M., Frosch, M. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis. Infection and Immunity. 75 (2), 899-914 (2007).
- Sokolova, O., et al. Interaction of Neisseria meningitidis with human brain microvascular endothelial cells: Role of MAP- and tyrosine kinases in invasion and inflammatory cytokine release. Cellular Microbiology. 6 (12), 1153-1166 (2004).
- Alimonti, J. B., et al. Zika virus crosses an in vitro human blood brain barrier model. Fluids and Barriers of the CNS. , (2018).
- Kim, B. J., Schubert-unkmeir, A. In vitro Models for Studying the Interaction of Neisseria meningitidis with Human Brain Endothelial Cells. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1969, 135-148 (2019).
- Kim, B. J., et al. Bacterial induction of Snail1 contributes to blood-brain barrier disruption. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2473-2483 (2015).
