يصف هذا البروتوكول استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد التغيرات في تكوين الخلايا المناعية ، وملف تعريف السيتوكين ، وملف تعريف الكيموكين في البيئة الرئوية بعد انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر ، وهو نموذج فئران للسكتة الدماغية الإقفارية.
قد يتغير توسع الخلايا المناعية وتنشيطها والاتجار بها إلى الرئتين ، والتي يتم التحكم فيها عن طريق التعبير عن السيتوكينات المتعددة والكيموكينات ، بسبب إصابة الدماغ الشديدة. ويتضح ذلك من حقيقة أن الالتهاب الرئوي هو سبب رئيسي للوفيات في المرضى الذين عانوا من السكتة الدماغية الإقفارية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف استخدام التحليل الخلوي للتدفق الخلوي متعدد الألوان لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية في رئتي الفئران ، بما في ذلك البلاعم السنخية ، والبلاعم الخلالية ، والخلايا المتغصنة CD103 + أو CD11b + (DCs) ، و DCs البلازما ، والحمضات ، والخلايا الوحيدة / الخلايا المشتقة من الخلايا الأحادية ، والعدلات ، والخلايا التائية والبائية المشتقة من اللمفاوية ، وخلايا NK ، وخلايا NKT ، بعد تحريض السكتة الدماغية الإقفارية عن طريق انسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر. علاوة على ذلك ، نصف تحضير متجانسات الرئة باستخدام طريقة تجانس الخرز ، لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو كيموكينات في وقت واحد بواسطة صفائف خرز متعددة الإرسال إلى جانب التحليل الخلوي للتدفق. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة المناعية الرئوية في بيئات الأمراض الأخرى ، مثل أمراض الرئة المعدية أو أمراض الحساسية.
الرئتين هي عضو حاجز ، يتعرض للبيئة الخارجية ، وبالتالي ، يتلقى باستمرار تحديات مناعية مثل مسببات الأمراض والمواد المسببة للحساسية1. مطلوب تنشيط الخلايا المناعية المقيمة في الرئة وتسلل الخلايا المناعية من المحيط لإزالة مسببات الأمراض من البيئة الرئوية. بالإضافة إلى ذلك ، تحافظ الخلايا المناعية المقيمة في الرئة على التسامح مع البكتيريا المصاحبة ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تلعب دورا في إزالة مسببات الأمراض والحفاظ على التوازن1. البلاعم السنخية والخلالية هي من بين الخلايا المناعية الخافرة المقيمة في الرئة التي تستشعر مسببات الأمراض عبر مستقبلات التعرف على الأنماط وتزيل هذه مسببات الأمراض عن طريق البلعمة2. تربط الخلايا المتغصنة المقيمة في الرئة الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية من خلال عرض المستضد3. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج الخلايا المناعية الفطرية المحلية المنشطة السيتوكينات والكيموكينات التي تضخم الاستجابة الالتهابية وتحفز تسلل الخلايا المناعية مثل الخلايا الوحيدة والعدلات والخلايا الليمفاوية إلى الرئتين1. وقد ثبت أن السكتة الدماغية الإقفارية تعدل المناعة الجهازية وتؤدي إلى زيادة القابلية للإصابة بالعدوى الرئوية. ومع ذلك ، فقد قامت دراسات قليلة بتقييم المقصورة الرئوية بعد السكتة الدماغية الإقفارية ، على الرغم من أن بعض الدراسات فحصتها خلال الظروف الالتهابية4،5،6،7،8،9. الهدف من الطرق الموضحة هنا هو تحديد أمراض الرئة وتكوين الخلايا المناعية ومستويات تعبير السيتوكين والكيموكين في الرئتين في وقت واحد لتقييم التغييرات في المقصورة الرئوية وتقييم التغييرات المحتملة في الاستجابة المناعية الرئوية بعد نوبة نقص التروية.
الموصوف هنا هو بروتوكول للحصول على تعليق خلية واحدة من رئتي الفئران لتحديد 13 نوعا من الخلايا المناعية. يعتمد هذا البروتوكول على هضم الأنسجة باستخدام الكولاجيناز D دون الحاجة إلى جهاز فصل الأنسجة الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول لإعداد متجانسات الأنسجة التي يمكن استخدامها لتحديد مستويات التعبير عن 13 سيتوكينات مختلفة أو chemokines باستخدام صفائف الخرز متعددة الإرسال القائمة على قياس التدفق الخلوي. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح للتحقيق في آثار السكتة الدماغية الإقفارية على المناعة الرئوية ويمكن استخدامه في نماذج الأمراض الأخرى أيضا.
تسمح البروتوكولات الموصوفة هنا بتحديد أنواع الخلايا المناعية الرئوية والتعبير عن الكيموكينات أو السيتوكينات في نفس الماوس. إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء دراسة لأمراض الأنسجة ، فيمكن إزالة الفص الفردي وتثبيته لهذا الغرض قبل المتابعة إلى خطوات عزل الخلية الواحدة. أحد القيود على هذه الطريق?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة P20 GM109098 وبرنامج جائزة الابتكار من Praespero إلى Edwin Wan. تم إجراء تجارب قياس التدفق الخلوي في منشأة WVU Flow Cytometry & Single Cell Core ، والتي تدعمها منح المعاهد الوطنية للصحة S10 OD016165 و U57 GM104942 و P30 GM103488 و P20 GM103434.
B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |