Een protocol om biologisch weefsel te bestuderen bij een hoge ruimtelijke resolutie met behulp van ultra-hoog veld magnetische resonantie microscopie (MRM) met behulp van microcoils wordt gepresenteerd. Stapsgewijze instructies zijn voorzien voor het karakteriseren van de microcoils. Ten slotte wordt optimalisatie van beeldvorming aangetoond op plantenwortels.
Dit protocol beschrijft een signaal-ruisverhouding (SNR) kalibratie- en monsterbereidingsmethode voor solenoïdale microcoils in combinatie met biologische monsters, ontworpen voor hoge resolutie magnetic resonance imaging (MRI), ook wel MR-microscopie (MRM) genoemd. Het kan worden gebruikt bij pre-klinische MRI-spectrometers, aangetoond op Medicago truncatula wortelmonsters. Microcoils verhogen de gevoeligheid door de grootte van de RF-resonator af te stemmen op de grootte van het interessant monster, waardoor hogere beeldresoluties in een bepaalde data-acquisitietijd mogelijk worden. Door het relatief eenvoudige ontwerp zijn solenoïdale microcoils eenvoudig en goedkoop te construeren en kunnen ze gemakkelijk worden aangepast aan de monstervereisten. Systematisch leggen we uit hoe nieuwe of zelfgebouwde microcoils kunnen worden gekalibreerd met behulp van een referentieoplossing. De kalibratiestappen omvatten: pulskrachtbepaling met behulp van een nutatiecurve; schatting van de homogeniteit van het RF-veld; en het berekenen van een volume-genormaliseerde signaal-ruisverhouding (SNR) met behulp van standaard pulssequenties. Belangrijke stappen in de voorbereiding van monsters voor kleine biologische monsters worden besproken, evenals mogelijke verzachtende factoren zoals magnetische gevoeligheidsverschillen. De toepassingen van een geoptimaliseerde solenoïde spoel worden aangetoond door hoge resolutie (13 x 13 x 13 μm3, 2,2 pL) 3D-beeldvorming van een wortelmonster.
Magnetische resonantie beeldvorming is een veelzijdig hulpmiddel om niet-invasief beeld een breed scala van biologische specimens, variërend van mensen tot enkele cellen1,2,3. Terwijl MRI-scanners voor medische beeldvormingstoepassingen doorgaans magneten gebruiken met een veldsterkte van 1,5 T tot 3 T, worden eencellige toepassingen afgebeeld op veel hogere veldsterktes1,3,4. De studie van specimens met resoluties van minder dan honderd micrometer wordt aangeduid als magnetische resonantiemicroscopie (MRM)5. MRM heeft echter last van een lage signaal-ruisverhouding (SNR) in vergelijking met andere beschikbare microscopie- of beeldvormingstechnieken (bijvoorbeeld optische microscopie of CT). Er kunnen verschillende benaderingen worden gevolgd om SNR6te optimaliseren. Een benadering is het gebruik van een hogere magnetische veldsterkte, terwijl een complementaire aanpak is het optimaliseren van de signaaldetector voor individuele monsters. Voor deze laatste moeten de afmetingen van de detector worden aangepast aan de afmetingen van het monster van belang. Voor kleine monsters met een diameter van ≈0,5-2 mm (bijvoorbeeld wortelweefsels) zijn microcoils nuttig omdat de SNR omgekeerd evenredig is met de spoeldiameter6,7. Resoluties tot 7,8 x 7,8 x 15 μm3 zijn bereikt op dierlijke cellen met behulp van speciale microcoils8. Er bestaan verschillende soorten microcoil, waarbij vlakke en solenoïde spoelen het meest worden gebruikt, afhankelijk van de toepassing en weefselgeometrie9. Vlakke spoelen hebben een hoge gevoeligheid dicht bij hun oppervlak, wat handig is voor toepassingen op dunne plakjes. Zo is bijvoorbeeld een methode beschreven die speciaal is ontworpen voor beeldvorming geperfundeerd weefsel voor vlakke microcoils10. Echter, vlakke spoelen hebben een hoge falloff van gevoeligheid en geen goed gedefinieerde referentie pulskracht. Solenoid spoelen, die cilindrisch, hebben een breder toepassingsgebied en zijn meer favoriet voor dikkere monsters. Hier beschrijven we de kenmerken van de solenoïde spoel, een protocol om monsters voor te bereiden op microcoil MRI, evenals de kalibratie van een solenoïde microcoil(figuur 1A).
De solenoïde spoel bestaat uit een geleidende draad opgerold, als een kurkentrekker, rond een capillaire bedrijf van het monster (Figuur 1B). Microcoilassemblages kunnen worden gebouwd met alleen emaille koperdraad, een assortiment condensatoren en een geschikte basis voor het solderen van de componenten (figuur 1B). De belangrijkste voordelen zijn de eenvoud en lage kosten, gecombineerd met goede prestatiekenmerken in termen van SNR per eenheid volume en B1 veld homogeniteit. Het bouwgemak maakt een snelle iteratie van spoelontwerpen en geometrieën mogelijk. De specifieke eisen van solenoïde microcoil ontwerp en sonde karakterisering (d.w.z., de theorie van elektronica, werkbankmetingen, en spectrometer metingen voor een verscheidenheid van coil geometrieën) zijn uitgebreid beschreven elders7,11,12,13,14.
Een solenoïde spoel kan worden gebouwd door rekening te houden met ontwerpregels voor de gewenste afmetingen volgens de elders beschreven richtlijnen15,16. In dit specifieke geval werd een spoel gebruikt met een binnendiameter van 1,5 mm, gemaakt van gemailde koperdraad, 0,4 mm in diameter, met een lus rond een capillaire van 1,5 mm buitendiameter. Deze solenoïde wordt gehouden op een basisplaat waarop een circuit is gemaakt, bestaande uit een tuningcondensator (2,5 pF), een variabele bijpassende condensator (1,5-6 pF) en koperen verbindingsdraden(figuur 1A, 1C). De tuningcondensator is gekozen om de gewenste resonerende frequentie van 950 MHz te bereiken, terwijl de bijpassende condensator is gekozen om de maximale signaaltransmissie te bereiken bij een impedantie van 50 Ohm. De grotere condensator is variabel om fijnere afstelling mogelijk te maken. Bij regelmatige werking worden tuning en matching uitgevoerd met behulp van condensatoren in de sondebasis. De geassembleerde microcoil moet op een sonde worden gemonteerd, zodat deze in de magneet kan worden geplaatst. Afhankelijk van het systeem kan een extra houder nodig zijn. Hier gebruiken we een 22.3 T magneetcombinatie met een Bruker Console Avance III HD in combinatie met een Micro5 probe. In dit geval hebben we een aangepaste steunwissel gebruikt die is uitgerust met de nodige aansluitingen om verbinding te maken met het 1H-kanaal van de sonde (figuur 1A).
Het op gevoeligheid afgestemde ontwerp van de spoel omvat een reservoir met geperfluoreerde vloeistof om de mismatches van de gevoeligheid te verminderen, die het gevolg zijn van het feit dat de koperen spoel zich in de nabijheid van het monster17besmachtigt . Een reservoir werd gemaakt van een plastic spuit om de spoel te omsluiten en gevuld met fomblin. Aangezien de geperfluoreerde vloeistof de spoel moet omsluiten, wordt de beschikbare diameter voor een monster teruggebracht tot een buitendiameter van 1 mm. Voor het gemak van het veranderen van monsters werd het monster bereid in een capillaire met een buitendiameter van 1 mm en een binnendiameter van 700 μm. De benodigde instrumenten voor de voorbereiding van de monsters zijn opgenomen in figuur 2A.
Fundamentele experimentele MR-parameters zijn sterk afhankelijk van de hardware van het gebruikte systeem, waaronder verloopsysteem, veldsterkte en console. Verschillende parameters kunnen worden gebruikt om de systeemprestaties te beschrijven, waarvan 90° pulslengte en vermogen, B1-homogeniteit en SNR per eenheidsvolume (SNR/mm3),het meest relevant zijn. SNR/mm3 is handig om de prestaties van verschillende spoelen op hetzelfde systeem te vergelijken18. Hoewel er hardwareverschillen tussen systemen kunnen bestaan, vergemakkelijkt de uniforme toepassing van een benchmarkingprotocol ook de vergelijking van de systeemprestaties.
Dit protocol richt zich op kalibratie en monstervoorbereiding. De stapsgewijze karakterisering van de prestaties van solenoïde microcoils wordt getoond: het kalibreren van de 90° pulslengte of -kracht; de beoordeling van de homogeniteit van het RF-veld; en de berekening van SNR per eenheidsvolume (SNR/mm3). Een gestandaardiseerde spin-echo meting met behulp van een fantoom wordt beschreven om een vergelijking van coil ontwerpen te vergemakkelijken, die het mogelijk maakt voor de optimalisatie van verschillende toepassingen. Phantom en biologische specimen monster preparaten, specifiek voor microcoils, worden beschreven. Het protocol kan worden toegepast op elke geschikte verticale magneet met smalle boringen (≤60 mm) die is uitgerust met een commercieel verkrijgbaar microimagingsysteem. Voor andere systemen kan het dienen als richtlijn en kan het worden gebruikt met enkele aanpassingen.
Biologische specimen voorbereiding voor MRI-metingen is meestal niet erg uitgebreid, omdat het monster is afgebeeld zo intact mogelijk. Luchtruimten in biologisch weefsel kunnen echter beeldartefacten veroorzaken als gevolg van verschillen in magnetische gevoeligheid19. Het effect neemt toe met toenemende magnetische veldsterkte20. Zo moeten luchtruimten worden vermeden bij hoge veldsterkte, en dit kan de onderdompeling van het monster in een vloeistof vereisen om lucht rond het weefsel te vermijden en de verwijdering van luchtruimten in de weefselstructuren. Specifiek, wanneer microcoils worden gebruikt, kan excisie van het gewenste monsterweefsel nodig zijn, gevolgd door het onder te dompelen in een geschikte vloeistof. Dit wordt gevolgd door het inbrengen van het monster in een voorgesneden capillair, en ten slotte het afdichten van de capillaire met capillaire was. Het gebruik van was als kit in plaats van lijm, vlamafdichting of alternatieven, betekent dat het monster gemakkelijk kan worden geëxtraheerd. Deze procedure wordt aangetoond op de wortel van Medicago truncatula, een kleine peulvruchtenplant. Een voordeel van dit protocol is het potentieel voor latere co-registratie van MRI-gegevens met optische microscopie, omdat het monster niet wordt vernietigd tijdens de MRI-meting.
Het gepresenteerde protocol is geschikt voor metingen met een hoge ruimtelijke resolutie in situ, en meer uitgebreide ontwerpen zouden beeldvorming in vivo monsters mogelijk kunnen maken, waar uitdagingen met betrekking tot levensondersteunende systemen zouden moeten worden aangepakt.
Dit protocol is het meest geschikt voor biologische monsters, omdat veel materialen en geologische monsters aanzienlijk kortere T2-ontspanningstijden hebben, die niet kunnen worden afgebeeld door de sequenties die hier worden gebruikt. Zelfs sommige biologische weefsels, die vertonen hoge monster magnetische gevoeligheid heterogeniteit, kan moeilijk zijn om beeld op ultra-hoog veld als de effecten zijn gecorreleerd aan het veld sterkte24. Het protocol is niet alleen nuttig voor nieuwe spoelen, maar kan ook helpen bij het oplossen van problemen en de diagnose van mogelijke problemen. Bij het testen van nieuwe of onbekende monsters kan dit protocol vooraf worden uitgevoerd op de referentieoplossing om te controleren of de experimentele installatie volgens de specificaties functioneert. Dit helpt bij het oplossen van problemen, omdat de spectrometer kan worden uitgesloten als een bron van artefacten en storingen. Bovendien stelt dit de tuning en bijpassende condensatoren op de sonde in op waarden die typisch zijn voor de microcoil.
Wanneer er bij het eerste experiment geen signaal wordt geregistreerd, kan het gezichtsveld van de localizerscan worden vergroot om te controleren of het monster wordt gezien. Controleer vervolgens opnieuw of de spoel correct is afgesteld en probeer een andere localizerscan. Het is mogelijk dat de spoel extra onbedoelde resonerende modi vertoont, in welk geval correcte moet worden bepaald. Als er nog steeds geen afbeelding kan worden verkregen, verwijdert u het monster om de positie ervan binnen de microkoecoilassemblage te controleren en te controleren of het monster intact is (d.w.z. er zijn geen luchtbellen of lekken in de afdichtingen aanwezig). Ten slotte kan een monster worden bereid met water in plaats van PFD. In het geval dat het monster geeft weinig detecteerbaar signaal in de localizer scan, het omringende water in de capillaire kan nog steeds worden gedetecteerd.
Aangezien microcoils idealiter zeer dicht bij het monster liggen, kunnen de magnetische gevoeligheidsverschillen tussen de lucht en de draad extra signaalverlies veroorzaken, zoals te zien is in figuur 7B. Potentiële artefacten omvatten ruimtelijke mismapping en afwijkende signaalintensiteit variatie. Vooral gradiënt-echo type puls sequenties worden beïnvloed door dit niet-uniforme signaalverlies. Om deze reden presenteerden we een gevoeligheid-matched spoel, door het onderdompelen van de draad in fluorinert vloeistof (Fomblin of FC-43). De B1-schattingsmethode in dit protocol kan helpen bepalen of de B1-gevoeligheidsverschillen de opname van gevoeligheidsmatchingstrategieën in het ontwerp van de coilassemblage rechtvaardigen. Een alternatieve benadering voor de bouw van een gevoeligheid afgestemd spoel is het gebruik van gevoeligheid-matched draad25. Bovendien worden met deze aanpak alleen gevoeligheidsproblemen als gevolg van de spoel aangepakt. Gevoeligheid mismatches in het monster (bijvoorbeeld als gevolg van luchtruimten) blijven uitdagend.
Luchtzakken of bellen vormen een experimentele uitdaging die veel signaalverlies veroorzaakt, veroorzaakt door gevoeligheidsverschillen op de interface van de lucht en de vloeistof of het monster19 (figuur 5A). Een cruciaal aspect van een succesvolle monstervoorbereiding is de onderdompeling van zowel monster als capillaire. Echter, zelfs kleine bellen kunnen leiden tot signaalverliezen, vooral voor gradiënt echo type sequenties. Mobiele luchtbellen kunnen door de capillaire migreren totdat ze in contact komen met het monster. Sommige van deze effecten kunnen worden verlicht door het capillaire licht te kantelen, zodat het ene uiteinde hoger is dan het andere. Kantelen zorgt ervoor dat potentiële luchtbellen op hun plaats worden gehouden aan de bovenkant, zonder het monster te verstoren. Het is ook belangrijk om te controleren of de capillaire was vormt een goede afdichting, als uitdroging kan leiden tot grote luchtbellen te vormen.
Voor de luchtruimten in het monster werd PFD gebruikt om de intercellulaire luchtruimten te vullen zonder de celmembranen te penetreren26. Echter, zelfs met deze aanpak, waren we niet in staat om alle luchtruimten te verwijderen. Bovendien betekent deze aanpak dat we een extra agent nodig hebben, wat meestal niet de voorkeur heeft vanwege de wens om een systeem zo niet-invasief mogelijk te bestuderen.
De cilindrische vorm van haarvaten betekent dat perfusieopstellingen levensvatbaar moeten zijn, vooral voor weefsels die kwetsbaar zijn voor verval, zoals biopten of het bestuderen van processen in levend wortelmateriaal. Twee stappen kunnen een perfusie-setup realiseren. Ten eerste zou het aansluiten van een medium feed tube en een afvoerbuis aan weerszijden van de capillaire voldoende zijn om een chemostat te creëren. Ten tweede kan de toevoeging van een inkeping in de capillaire monster het monster op zijn plaats houden tegen de stromingsrichting. Dit is analoog aan een protocol gepubliceerd voor planaire microcoils10.
Het niet-invasieve karakter van MR-beeldvorming, in combinatie met de inerte vloeistof die in dit protocol wordt gebruikt (PFD of Fomblin), betekent dat monsters na voltooiing van experimenten uit hun haarvaten kunnen worden verwijderd voor verder onderzoek. Combinaties omvatten optische of elektronenmicroscopie en andere destructieve beeldvormingstechnieken. We hebben onlangs aangetoond een combinatie met optische microscopie op Medicago truncatula wortel knobbeltjes27.
We hebben een methode voor het beeldvorming van plantaardig materiaal aangetoond met behulp van speciale microcoils op een ultra-hoog veld NMR spectrometer. De vrij grote steekproefvolumes kunnen bij hoge resolutie met goede homogeniteit RF worden bestudeerd. Bovendien kan spectroscopische beeldvorming worden uitgevoerd op hogere resoluties dan anderszins haalbaar is. Het aanpassen van het ontwerp van microcoil aan monsters wordt vergemakkelijkt door een efficiënte methode om de kenmerken van de spoelprestaties te bepalen. De solenoïde spoelbenadering kan ook gemakkelijk worden toegepast op andere monsters dan planten, waaronder dierlijk weefsel.
The authors have nothing to disclose.
Experimenten op het 950 MHz-instrument werden ondersteund door uNMR-NL, een door NWO gefinancierde Nationale Roadmap Grootschalige Faciliteit Nederland (project 184.032.207). R.S. werd ondersteund door het Consortium U2.3 van BioSolarCells. J.R.K. werd ondersteund door de Nederlandse Magnetic Resonance Research School (NMARRS) graduate school [022.005.029]. Wij danken Defeng Shen en Ton Bisseling voor het verstrekken van de Medicago truncatula monsters. Verder danken we Klaartje Houben, Marie Renault en Johan van der Zwan voor technische ondersteuning in de uNMR-NL faciliteit. We willen ook Volker Lehmann, Henny Janssen en Pieter de Waard bedanken voor technische hulp. We spreken onze dank uit aan Frank Vergeldt, John Philippi en Karthick B. Sai Sankar Gupta voor hun advies. Tot slot bedanken we Jessica de Ruiter voor het leveren van de voice-over van de video.
Reference solution preparation | |||
CuSO4 | Sigma-aldrich | 469130 | Crystalline powder for creating reference solution |
D2O | Sigma-aldrich | 151882 | Liquid used to prepare reference sample |
Weigh Scale | Sartorius | PRACTUM513-1S | Scale for weighing compounds |
Sample preparation | |||
Capillary 1000 μm (Outer diameter) | Hilbenberg GmbH | 1408410 | Sample capillaries |
Capillary wax | Hampton Research | HR4-328 | Solid wax used to seal samples |
Disposable Scalpel | Swann-Morton | No. 11 | Used to excise samples |
Perfluorodecalin | Sigma-aldrich | P9900 | Liquid used for submerging sample |
Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | Tabletop binocular microscope |
Syringe | Generic | – | Used to apply PFD and manipulate the sample |
Vacuum Pump | Vacuubrand | MZ2C | Two-stage membrane vacuumpump used for removing air pockets from samples. |
Wax pen | Hampton Research | HR4-342 | Handheld wax pen used to melt and apply capillary wax to samples |
Imaging Hardware | |||
22.3 T Magnet | Bruker GmbH | 950 US2 | Narrowbore superconducting magnet |
Air cooler | Bruker GmbH | – | Used to regulate probe temperature |
Console | Bruker GmbH | Avance III HD | Controls operation of the spectrometer |
Micro5 gradient coils | Bruker GmbH | Mic5 | Removable gradient coils mount on the Micro5 probe body |
Micro5 Probe body | Bruker GmbH | Mic5 | Holds microcoils and gradient coils |
RF microcoil | Home-built | – | contains Fomblin |
Vector Network Analyzer | Copper Mountain Technologies | TR1300/1 | Used to perform S11 reflectance test, frequency range 300kHz to 1.3 GHz |
Water cooler | Bruker GmbH | BCU-20 | Open loop watercooling to dissipate heat from gradient coil operation. |