Het blokkeren van lymfestroom door het hechten van Afferent Lymfatische bloedvaten in muizen
Summary
Een protocol om lymfestroom te blokkeren door chirurgische hechting van afferent lymfevaten wordt gepresenteerd.
Abstract
Lymfevaten zijn van cruciaal belang bij het handhaven van de balans van weefselvloeistof en het optimaliseren van de immuunbescherming door het vervoer van antigenen, cytokines en cellen naar drainerende lymfeklieren (LN’s). Onderbreking van de lymfestroom is een belangrijke methode bij het bestuderen van de functie van lymfevaten. De afferente lymfevaten van het murine voetpad tot de popliteale lymfeklieren (pLN’s) zijn goed gedefinieerd als de enige routes voor lymfedrainage in de pLN’s. Het hechten van deze afferente lymfevaten kan selectief voorkomen lymfestroom naar de pLN’s. Deze methode zorgt voor interferentie in de lymfestroom met minimale schade aan de lymfe-endotheelcellen in de drainerende pLN, de afferente lymfevaten, evenals andere lymfevaten rond het gebied. Deze methode is gebruikt om te bestuderen hoe lymfe hoge endotheelvenules (HEV) en chemokine expressie in de LN beïnvloedt, en hoe lymfe stroomt door het vetweefsel rond de LN bij afwezigheid van functionele lymfevaten. Met de groeiende erkenning van het belang van lymfefunctie, zal deze methode bredere toepassingen hebben om de functie van lymfevaten verder te ontrafelen bij het reguleren van de LN-micro-omgeving en immuunresponsen.
Introduction
De ruimtelijke organisatie van het lymfestelsel biedt structurele en functionele ondersteuning om extracellulaire vloeistof efficiënt te verwijderen en antigenen en antigeen-presenterende cellen (APC’s) naar de drainerende LN’s te transporteren. De eerste lymfevaten (ook wel lymfekapillaries genoemd) zijn zeer doorlatend vanwege hun discontinu intercellulaire knooppunten, die de effectieve verzameling van vloeistoffen, cellen en andere materialen uit omliggende extracellulaire ruimten1vergemakkelijken. De eerste lymfevaten fuseren tot het verzamelen van lymfevaten, die strakke intercellulaire knooppunten, een continu keldermembraan en lymfespierdekking hebben. Het verzamelen van lymfevaten zijn verantwoordelijk voor het transport van verzamelde lymfe naar de drainerende LNs en uiteindelijk terug te keren lymfe naar de circulatie2,3. De verzamelende lymfevaten die lymfe in de drainerende LN voortdrijven zijn de afferente lymfevaten4,5,6,7. Obstructie van afferent lymfevaten kan de lymfestroom in de LNs blokkeren, wat een nuttige techniek is bij het bestuderen van de functie van lymfestroom.
Eerdere studies hebben aangetoond dat lymfestroom een belangrijke rol speelt bij het transport van antigenen en APC’s, evenals het behoud van LN homeostase. Het is goed begrepen dat weefsel-afgeleide APC’s, meestal geactiveerd migrerende dendritische cellen (DC’s), reizen door de afferent lymfevaten naar de LN te activeren T-cellen8. Het idee dat antigenen in vrije vorm, zoals microben of oplosbare antigenen, passief met lymfe naar het LN stromen om LN-resident APC’s te activeren, is in het afgelopen decennium 9,10,11,12. Antigenen in vrije vorm die met lymfe reizen, duren enkele minuten na de infectie om naar de LN te reizen en de LN-resident celactivering kan binnen 20 minuten na de stimulatie optreden. Dit is veel sneller dan de activering van migrerende DC’s, die meer dan 8 uur duurt om de drainerende LN9in te voeren. Naast het vervoer van antigenen om immuunbescherming te starten, draagt lymfe ook cytokines en DC’s naar de LN om zijn micro-omgeving te behouden en om immuuncelhomeostase13,14te ondersteunen . Eerder, het blokkeren van lymfestroom door het hechten van de afferent lymfevaten aangetoond dat lymfe nodig is om de HEV fenotype dat nodig is voor de ondersteuning van homeostatische T-cel en B-cel homing aan de LN15,16,17te handhaven . CCL21 is een kritieke chemokine die dc- en T-celpositionering in de LN8,18regisseert. Het blokkeren van lymfestroom onderbreekt CCL21-expressie in de LN en onderbreekt mogelijk dc- en T-celpositionering en/of interactie in de LN19. Zo kan het blokkeren van lymfestroom direct of indirect antigeen/DC-toegang tot de drainerende LN intrekken door de LN-micro-omgeving te verstoren die de immuunresponsen in de LN reguleert. Om de functie van lymfestroom beter te onderzoeken, wordt een experimenteel protocol gepresenteerd (Figuur 1) om de lymfestroom bij muizen te blokkeren door de affenerende lymfevaten van het voetpad naar de pLN te hechten. Deze methode kan een belangrijke techniek zijn voor toekomstige studies over lymfefunctie bij gezonde en zieke aandoeningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het blokkeren van lymfestroom zal brede toepassingen hebben bij het manipuleren van antigeenlevering aan de LN in gezonde en zieke omstandigheden. Het is mogelijk om deze methode te gebruiken om de timing van de levering van antigeen te controleren om te bestuderen hoe continue lymfestroom de immuunrespons regelt bij het aftappen van LNs. Deze methode van lymfestroom onderbreking kan ook worden gebruikt om te bestuderen hoe lymfe effecten cel compartimentalisatie, celactivering, celmigratie, en celcel interacties in de L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Ava Zardynezhad voor het proeflezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door het Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) en de Canada Foundation for Innovation for SL (32930) en de National Natural Science Foundation of China voor Yujia Lin (81901576).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Saline | Baxter | JB1323 | |
| 100% ethanol | Greenfield Global | University of Calgary distribution services UN1170. | |
| Depilatory cream | Nair | Nair Sensitive Formula Hair Removal Crème with Sweet Almond Oil and Baby Oil, 200-ml. Or similar product. | |
| Evans Blue dye | Sigma Life Science | E2129-10G | For 1 ml of Evans blue dye, add 0.1g Evans blue to 10 ml PBS. The Evens Blue solution will be filtered through 0.22 mm filters and kept sterile in 1ml aliquots. |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma Life Science | F7250-1G | |
| Forceps Dumont #3 | WPI | 500337 | |
| Forceps Dumont #5 | WPI | 500233 | |
| Injection apparatus | Connect one end of polyethylene tubing to 30G × ½ needle. Attach a 1ml TB syringe to the needle. Dislodge needle shaft from another 30G × ½ needle. Insert the blunt end of the 30G × ½ needle shaft into the other end of the tubing. The inside diameter of this tubing is 0.28mm. Thus, 1.6 cm of fluid in the tubing is 1 μl. | ||
| Insulin syringe | Becton Dickinson and Company (BD) | 329461 | |
| IRIS Forcep straight | WPI | 15914 | |
| IRIS scissors | WPI | 14218-G | |
| Ketamine | Narketan | DIN 02374994 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Needles (26Gx3/8) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305110 | |
| Needles (30Gx1/2) | Becton Dickinson and Company (BD) | 305106 | |
| Paton Needle Holder | ROBOZ | RS6403 | Straight, Without Lock; Serrated |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Science | P4417-100TAB | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company (BD) | 427401 | |
| Surgical tape (1.25cmx9.1m ) | Transpore | 1527-0 | |
| Surgical tape (2.5cmx9.1m ) | Transpore | 1527-1 | |
| Suture | Davis and Geck CYANAMID Canada | 11/04 | 0.7 metric monofilament polypropylene |
| Syringe (1ml) | Becton Dickinson and Company (BD) | 309659 | |
| VANNAS scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14122-G | |
| Xylazine | Rompun | DIN02169606 | The suppliers of Ketamine and Xylazine are usually under institutional and governmental regulation. |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Olympus | Olympus S261 (522-STS OH141791) with light source: Olympus Highlight 3100 | |
| Confocal microscope | Leica | SP8 |
References
- Pflicke, H., Sixt, M. Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).
- Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).
- Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle. Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).
- Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph. The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).
- Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels. Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).
- Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct. Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).
- Breslin, J. W., et al. Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread. Cell. 150, 1235-1248 (2012).
- Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens. Immunity. 42, 172-185 (2015).
- Moussion, C., Girard, J. P. Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules. Nature. 479, 542-546 (2011).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).
- Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone. Immunology. 71, 423-427 (1990).
- Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression. Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).
- Mebius, R. E., et al. Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow. Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).
- Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis. Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).
- Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment. Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).
- Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice. Journal of Biological Methods. 1, 6 (2014).
- Lin, Y., et al. Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route. Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).
- Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095 (2016).
