Drosophila Melanogaster Sirkadiyen Entrainment

1. Fly gıda üretimi Her 1 L su için 4,69 g kurutulmuş pekmez, 19,70 g kuru aktif maya, 87,22 g mısır unu ve 7,83 g agar dan oluşan sinek liyat hazırlayın. Yukarıda listelenen içeriği bir güveçte birleştirin ve ısıyı 250 °F’ye çevirin. Mix yanı sıra malzemeler eklenir. Sinek gıda ısıtma gibi crockpot üzerinde kapak tutun da bir haddeleme kaynatın ulaşana kadar her 10 dakikada bir içeriğini karıştırma. Haddeleme kaynama yalıtma ısı kapatmadan önce 20 dakika boyunca devam etmesine izin verin. 83,60 mL su ekleyin ve gıda soğudukça tencerenin kapağını kapalı tutun. Karışımı ve bir cam termometre ile her 10 dakikada bir gıda sıcaklığını kaydedin. Bir film tabakasının yemeğin üzerine yerleşmesine izin vermekten kaçının. Gıda lar 60 °C’ye soğuduktan sonra, eklenen suyun litresine 10,44 mL Tegosept ve 5,51 mL propiyonik asit ekleyin (bkz. adım 1.1). İyice karıştırın ve yiyeceklerin çok serin olmasını önlemek için 60 °C’ye kadar ısıtın. Droso-dolgu kullanarak gerektiği gibi sinek gıda pompalayın. Dar şişeler için, pompa 10 mL ve 6 oz kare alt şişe pompa 60 mL. 2. Tanımlanmış yaşta sinek toplama Şişenin yan tarafına büyük miktarlarda pupa (yaklaşık 200 pupa) bağlanına kadar 25 °C’de 5-7 gün boyunca saklanan yabani tip sineklerin monitör şişeleri. Kullanılan şişekare dipleri ile 6 oz Drosophila stok şişevardır. Mevcut yetişkinleri şişeden temizleyin. Ya yeni bir şişe içine yetişkin ucu ya da% 70 etanol yerleştirin. Kalan yetişkinleri sinek yiyeceğine itmek için #0 bir fırçanın donuk ucunu kullanın. Kullanımdan önce ve sonra boya fırçasını etanol ile sildiğime emin olun. Temizlenmiş şişelerin 25 °C’lik bir kuluçka makinesinde 3 gün boyunca oturmasını bekleyin ve böylece yeni neslin kapanmasına izin verin. Bu sinekler 0 ile 3 günlük arasında olacak. 3. Sinek ayırma 3 gün sonra, dişilerden ayrı erkek ve dört zaman puan her biri için her cinsiyet için istenen sayıyı toplamak. Sinekler cinsel organı inceleyerek cinsiyetle ayırt edilebilir; erkeklerde koyu yuvarlak cinsel organlar, kadınlarda ise daha açık ve sivri cinsel organlar vardır. Dişiler de erkek sineklerden çok daha büyüktür. Sinekleri etkili bir şekilde ayırmak ve cinsiyetleri ayırt etmek için bir CO2 anestezi pedi kullanın. Onları öldürmemek için boya fırçaları ile sinekler taşıyın. Her zaman noktası için 100 erkek ve 100 kadın toplayın, şişe başına 50 erkek ve şişe başına 100 kadın. Erkekler daha agresif olma eğilimindedir ve bir şişe de 100 bireyler olduğunda sosyal etkileşimleri ölümlere yol açar. 100’e kadar olan dişiler, şişede bulunurken etkilenmezler. Koleksiyonları aşağıdaki zaman noktalarında gerçekleştirin: ZT1, ZT7, ZT13 ve ZT19 (Tablo 1). Karanlıkta yapılan koleksiyonların (ZT12-ZT24) ışığa duyarlı olduğunu, ZT0-ZT11 koleksiyonlarının ışık açık saatlerinde yapıldığını ve oda ışıklarının açık olabileceğini unutmayın. Tüm koleksiyonların bir gecede değil, gün içinde gerçekleşmesine izin vermek için ters 12 saatlik ışık desenleriyle iki ayrı kuluçka makinesi nin kullanıldığını lütfen unutmayın. Gelecekteki entrainment için sinek yeni şişe oluşturmak için aşırı sinekkullanın. Her yeni şişeye 5-7 erkekli 25 dişi yerleştirin ve 25 °C’de kuvöze yerleştirin. 4. Sinek kuluçka Sirkadiyen entrainment gerçekleşmesi için 3-5 gün boyunca Hafif düzenlenmiş kuvözlerde kalmak için sinekler izin verin. Kuvözlerin Hafif sıkı olduğundan emin olun, çünkü az miktarda ışık kirliliği bile eğitimi bozacaktır. 5. İmmünofluoresans fiksasyonu Entrainment sonra, immünoresans için kullanılacak örnekler için fiksasyon çözeltisi yeni şişeler hazırlamak. Sinekleri kuvözden çıkarmadan önce, sabitlenecek her 100 sinek için her yeni dar şişeye 1x PBS + %0,1 Ara-20’de seyreltilmiş %4 formaldehit 4.8 mL ekleyin. Her şişede 100 erkek ya da 100 dişi Sirkadiyen entrained sinek barındıracak. Dar şişeleri buza yerleştirin. 6. İmmünofluoresans toplama İmmünfloresan için kuvözden sinekleri toplarken, şişe kapağını çıkarın ve şişeyi huniye hızla ters çevirin. Yavaşça şişe içine sinekler rehberlik yardımcı olmak için huni ile çözüm içine sinekler dokunun; bir şişe de 100 erkek toplam 50 erkek iki tüp birleştirmek ve diğer şişe için 100 kadın tek bir tüp kullanın. ZT13 ve ZT19 koleksiyonlarını karanlıkta gerçekleştirin; drosophila olarak görmek için kırmızı ışık kullanmak çok daha az bu ışık dalga boylarına duyarlı ve bu nedenle ışık kirliliği daha az eğilimli13. Kriptokrom protein, özellikle, kaçınılmalıdır mavi ışığa özellikleduyarlıdır 14. Işık maruziyetini azaltmak için, toplama odasının herhangi bir ışık kaynağıyla kapalı veya kapalı olduğundan emin olun. Aşağıdaki adımda besleyici mikser üzerine yerleştirildiğinde ZT13 ve ZT19 sineklerinin ışığa maruz kalması için bu şişeleri folyoya sarın. ZT1 ve ZT7 sinekleri ışığa duyarlı değildir ve folyo kaplama olmadan mikser üzerine yerleştirilebilir. 7. Besleyici mikser ve depolama Sinekler toplandıktan sonra, dökülmeyi önlemek için fiksatif içeren şişelerin üstünü bantlayın ve 4 saat boyunca 4 °C’de 165 RPM’de besleyici mikserin üzerine yerleştirin. Sinekler bu fiksasyon adımından sonra artık ışığa duyarlı değildir, bu nedenle çözeltinin hareket halinde olduğunu doğrulamak için folyo çıkarılabilir ve sinekler fiksatife batırılır. Besleyici mikserden şişe içeren sineği çıkardıktan sonra formaldehiti çıkarın ve 3.000 μL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve her yıkamada şişeyi ters çevirin. Gelecekte immünoresans15beklemek için immünoresans örneklerini taşıyan şişeleri 4 °C’de saklayın. 8. Protein ekstraksiyonu için toplama Protein ekstraksiyonu için numunelerin korunması için dört adet 50 mL tüp ve sıvı nitrojen içeren bir Dewar hazırlayın Protein veya nükleik asit ekstraksiyonu için sinek toplamak için, transfer sinekler adım 6.1 aynı şekilde tüp şişe sinekler ve hızlı bir şekilde sineklerin salınımını önlemek için tüp kap ve dondurma snap sıvı nitrojen içine tüp yerleştirin. 9. Protein ekstraksiyonu için depolama -80 °C’de protein ekstraksiyonu için dondurulmuş numuneleri saklayın. Bunlar, immünoblotting16dahil olmak üzere, downstream analizi için uygun protein ekstraksiyon protokolüne göre işlenebilir.