Циркадная обучение Дрозофилы Меланогастер

1. Производство продуктов питания на лету На каждые 1 л воды готовят мухомо пищу, состоящую из 4,69 г сушеной патоки, 19,70 г сухих активных дрожжей, 87,22 г кукурузной муки и 7,83 г агара. Объедините содержимое, перечисленное выше, в кастрюле и поверните тепло до 250 градусов по Фаренгейту. Хорошо перемешать, как ингредиенты добавляются. Держите крышку на кастрюлю, как муха пища нагревается, а также смешивания содержимого каждые 10 минут, пока не достигнет кипения. Разрешить прокатки кипения продолжать в течение 20 минут, прежде чем выключить огонь. Добавьте 83,60 мл воды и держите крышку кастрюли, как пища охлаждается. Смешайте и замитмите температуру пищи каждые 10 минут со стеклянным термометром. Не позволяйте слой пленки оседают на верхней части пищи. После того, как пища остынет до 60 градусов по Цельсию, добавьте 10,44 мл тегосепта и 5,51 мл пропионовой кислоты на литр добавленной воды (см. шаг 1.1). Хорошо перемешайте и поверните нагреть до 60 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить слишком прохладное питание. Насос летать пищи по мере необходимости с помощью Droso-наполнителя. Для узких флаконов, насос 10 мл и для 6 унций квадратных нижних бутылок насоса 60 мл. 2. Сбор мух определенного возраста Монитор бутылки диких мух типа хранится при 25 градусов по Цельсию в течение 5-7 дней, пока большое количество куколки (около 200 куколок) прилагаются к стороне бутылки. Бутылки используются 6 унций Drosophila фондовых бутылок с квадратным дном. Очистим существующих взрослых от бутылки. Либо наконечник взрослых в новую бутылку или поместите их в 70% этанола. Используйте унылый конец #0, чтобы подтолкнуть оставшихся взрослых в пищу мухи. Будьте уверены, чтобы протереть краску щеткой вниз с 70% этанола до и после использования. Разрешить очищены бутылки сидеть в течение 3 дней в инкубаторе 25 градусов по Цельсию, чтобы для следующего поколения, чтобы исключить. Этим мухам будет от 0 до 3 дней. 3. Разделение мух Через 3 дня отделяем самцов от самок и собираем нужное количество для каждого пола для каждого из четырех пунктов времени. Мухи могут быть дифференцированы по полу путем изучения гениталий; мужчины имеют темные округлые гениталии в то время как женщины имеют более светлые, более остроконечные гениталии. Самки также намного крупнее самцов мух. Используйте CO2 анестезии площадку эффективно отделить мух и различать полов. Перемещение мух с краской кисти, чтобы избежать их убийства. Соберите 100 мужчин и 100 женщин для каждой точки времени, с 50 мужчин на флакон и 100 женщин на флакон. Мужчины, как правило, более агрессивным и их социальные взаимодействия приводят к много смертей, когда Есть 100 человек во флаконе. Самки до 100 особей не затрагиваются, находясь во флаконе. Выполняем коллекции в следующих точках времени: NoT1, NoT7, ЗТ13 и ЗТ19(таблица 1). Обратите внимание, что коллекции, выполненные в темное время суток (ЗТ12-ЗТ24), светочувствительны, в то время как коллекции ЗТ0-ЗТ11 выполнены во время освещения и света комнаты. Обратите внимание, что два отдельных инкубатора используются с обратными 12-часовыми световыми узорами, позволяющими всем коллекциям происходить в течение дня, а не на ночь. Используйте лишние мухи, чтобы создать новые бутылки мух для будущего вовренности. Поместите 25 самок с 5-7 самцами в каждую новую бутылку и поместите в инкубатор при 25 градусов по Цельсию. 4. Инкубация мух Разрешить мухам оставаться в свет регулируется инкубаторов в течение 3-5 дней, чтобы циркадные увлечение происходит. Убедитесь, что инкубаторы светоемкие, потому что даже небольшое количество светового загрязнения будет беспокоить увлечение. 5. Фиксация иммунофлюоресценции После заезда подготовьте новые флаконы фиксационерного раствора для образцов, которые будут использоваться для иммунофлуоресценции. Перед удалением мух из инкубатора добавьте 4,8 мл 4% формальдегида, разбавленного в 1x PBS, и 0,1% Tween-20 к каждому новому узкому флакону на каждые 100 мух, которые должны быть зациклены. Каждый флакон будет в доме 100 мужчин или 100 женщин circadian заключенных мух. Поместите узкие флаконы во льду. 6. Коллекция иммунофлуоресценции При сборе мух из инкубатора для иммунофлуоресценции, удалить крышку бутылки и быстро инвертировать бутылку в воронку. Аккуратно нажмите мух в раствор через воронку, чтобы помочь направлять мух во флакон; объединить две трубки из 50 мужчин в общей сложности 100 мужчин в одном флаконе и использовать одну трубку из 100 женщин для другого флакона. Выполняем коллекции Т13 и Т19 в темноте; использовать красный свет для того, чтобы увидеть, как дрозофила гораздо менее чувствительны к этим длинам волн света и, следовательно, менее склонны к световомузагрязнению 13. Криптохромный белок, в частности, особенно чувствителен к синему свету, которого следуетизбегать 14. Чтобы уменьшить воздействие света, убедитесь, что комната сбора свет плотно с любыми источниками света заблокированы или покрыты. Оберните эти флаконы в фольгу так, чтобы мухи ЗТ13 и ЗТ19 не подвергались воздействию света при размещении на гайке смесителя на следующем этапе. Мухи ЗТ1 и ЗТ7 не светочувствительны и могут быть помещены на смеситель без покрытия фольгой. 7. Питательный смеситель и хранение После того, как мухи были собраны, лента верхней части флаконов, содержащих фиксатор, чтобы избежать разлива и поместить их на ореховый смеситель при 165 об /мин при 4 градусов по Цельсию в течение 4 ч. Мухи больше не светочувствительны после этого шага фиксации, так что фольга может быть удалена, чтобы проверить решение движется и мухи погружаются в фиксатор. После удаления мухи, содержащей флаконы из орехового смесителя удалить формальдегид и мыть три раза с 3000 йл 1x PBS, инвертирование флакона с каждой стирки. Храните флаконы с образцами иммунофторесценции при 4 градусах Цельсия в ожидании будущего иммунофлюоресценции15. 8. Сбор для извлечения белка Подготовка четырех трубок объемом 50 мл и двойки, содержащей жидкий азот, для сохранения образцов для извлечения белка Для сбора мух для извлечения белка или нуклеиновой кислоты, передача мух из бутылок в трубку таким же образом, как в шаге 6.1 и быстро крышка трубки, чтобы предотвратить высвобождение мух и поместить трубку в жидкий азот, чтобы оснастки заморозить. 9. Хранение для извлечения белка Храните замороженные образцы для извлечения белка при -80 градусов по Цельсию. Они могут быть обработаны в соответствии с протоколом извлечения белка подходит для анализа вниз по течению, в том числеиммуноблоттинг 16.