在存在治疗性抗体的情况下，由FcγRIIIa参与驱动的人类自然杀伤细胞事件的评估

以下协议符合iQ生物科学人类研究伦理委员会的指导方针。 1. PBMC的分离和NK细胞的富集/纯化 注意：也可以进行外周血单核细胞（PBMC）分离和富集/纯化的其他方法。 在调节条件下将200毫升血液吸入含有肝素的管中。 将15 mL密度梯度培养基加入到掺入多孔屏障的50 mL管中。以1000 x g 旋转管子30秒。 将12.5毫升血液加入试管中，然后再加入12.5毫升PBS，并轻轻倒置3倍。在室温（RT）下以 800×g 旋转管子15分钟，没有断裂。 在细胞旋转时，为每根管准备一个50 mL锥形管，其中40 mL PBS具有多孔屏障。 小心地取出管子，并在离心后进行检查。检查多孔屏障上方的 20 mL 和 25 mL 分界线之间是否有一层薄而明显的白色 PBMC 层。 使用移液器小心地从顶部取出尽可能多的液体，而不会干扰薄薄的白色PBMC层。 使用干净的10 mL血清学移液器，轻轻除去PBMC层以及透明，淡黄色的液体层，直到管的过滤器。 将PBMC和液体排出到步骤1.4中制备的含有PBS的50 mL锥形中。在室温下旋转管，300 x g 5分钟。 吸出PBS洗涤液，再加入40 mL PBS。在室温下旋转管，300 x g 5分钟。 洗涤后，计数细胞并将其重悬在每1×107 个细胞的40μL2%BSA / PBS中。 使用所选方法进行NK细胞的分离。选择包括手动或自动磁珠基分选9、21。荧光激活的细胞分选也可以进行22。 通过流式细胞术除去一小块等分试样，以确定NK细胞的纯度。门控策略包括以下内容：基于前向与侧散射曲线对活细胞的门，然后根据特定活体群体中的NK标记物（例如CD3，CD56）评估纯度。典型纯度为>95%。 分离完成后，在室温下旋转细胞和 300×g5 分钟以沉淀和吸出。 将细胞沉淀重悬至1 x 107 个细胞/ mL的RPMI 1640中，具有营养物质，10%热灭活FBS，1mM丙酮酸钠，55mM 2-ME和10mM HEPES（pH = 7.2）。 2. 抗体介导的通过FcγRIIIa激活NK细胞 将冷藏微量离心机设置为4°C。 将1 x 10 6（100μL）重悬的NK细胞分配到1.5mL管中并置于冰上。注意：如果样品数量众多，可以将细胞分配到96孔U底板中。 每个样品制备1μL100μg/ mL利妥昔单抗（或目标抗体），并向细胞中加入1μL，最终浓度为1μg/ mL抗体。注意：其他分子可以在此时或更早添加到细胞中，以评估组合效应。在这里，利替单抗用于刺激。在先前的研究中，小分子抑制剂已被添加到刺激9中。 将样品在冰上孵育30分钟。在孵育过程中，在培养基中制备每个样品50μL50μg/ mL抗人κ轻链抗体，并在热块或水浴中加热至37°C。 在冰上孵育细胞后，加入1mL冰冷培养基，并在4°C下以 135×g 旋转5分钟。 用 1 mL 冰冷培养基再次洗涤。 在最后一次洗涤后吸出上清液，并加入步骤2.5中制备的50μL抗人κ轻链混合物。 立即将样品在37°C的加热块或水浴中为最终用户确定的时间点孵育。 通过加入1mL冰冷培养基停止刺激，并立即在 135×g 的冷藏离心机中旋转样品5分钟。用 1 mL 冰冷培养基再次清洗。 3. 下游应用和读数 通过蛋白质印迹分析询问FcγRIIIa刺激的NK细胞中的信号分子注意：可以使用不同的蛋白质分离和膜转移装置。 在最后一次用冰冷培养基洗涤（步骤2.8）后，用20μL含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞在冰上混合30分钟。 在4°C下以 2100×g 离心管15分钟。 将裂解物转移到干净的1.5 mL管中，并加入蛋白质分离所需的试剂。 将蛋白质分离到SDS-PAGE凝胶上，并按照标准方案转移到硝酸纤维素或PVDF膜上。 根据制造商的一级检测抗体数据表（此处使用pAKT，pPRAS 40和pERK1 / 2）阻断和探针膜。 根据制造商对 PVDF 膜的建议，添加 HRP 偶联二抗和化学发光试剂。使用X射线胶片或检测仪器进行可视化（此处，pAKT在60 kDa下检测到，pPRAS40在40 kDa时检测到，pERK1/2在42 kDa和44 kDa下检测到）。 mRNA的分离和FcγRIIIa刺激的NK细胞基因表达分析的制备（材料表） 达到刺激的时间点（步骤2.7）后，将管子放在冰上，并立即在135×g的冷藏离心机中旋转5分钟（类似于步骤2.8）。 取出上清液，用1 mL冰冷的PBS洗涤2次。 使用异硫氰酸胍RNA提取裂解细胞（材料表）。使用1μgmRNA使用带有商业试剂盒的随机六聚体进行逆转录（材料表）。注：任何RNA提取或cDNA合成方法均可采用9、23、24。 将cDNA在-20°C下冷冻，直到基因表达分析。 FcγRIIIa刺激的NK细胞的细胞骨架重排评估 在最后一次用冰冷培养基洗涤（步骤2.8）后，用50μL3.7%多聚甲醛在室温下重悬细胞沉淀10分钟。 加入1 mL PBS，在室温下以135 x g 离心5分钟。 加入100μL0.1%Triton X-100 / PBS5分钟以透化细胞，并在室温下以 135×g 离心细胞5分钟以沉淀。 加入100μL5单位/ mL AF488标记的鬼臼素稀释在1%BSA / PBS中，并在室温下孵育20分钟。 加入1 mL PBS，在室温下以135 x g 离心5分钟以洗涤。将细胞沉淀重悬于所需体积，以进行流式细胞术分析。 使用CD107a表面染色评估FcγRIIIa刺激的NK细胞的脱颗粒 如步骤2.1-2.4所述，用感兴趣的抗体在冰上孵育细胞。在孵育过程中，每个样品制备50μL抗体混合物。在终浓度为50μg/ mL抗人κ轻链抗体和1μg/ mL荧光染料标记CD107a的细胞培养基中制备混合物。 在冰上孵育细胞后，加入1mL冰冷培养基。在4°C下以 135×g 旋转5分钟，然后用1mL冰冷介质再次洗涤。 在最后一次洗涤后吸出上清液，然后加入50μL抗人κ轻链混合物，并在37°C下孵育所需的时间点。 在所需的时间点，加入1mLPBS，在室温下以 135×g 离心5分钟，吸出上清液并加入100μL4%多聚甲醛。在室温下孵育10分钟。 加入1 mL PBS，在室温下以135 x g 离心5分钟以洗涤。将细胞沉淀重悬于所需体积，以进行流式细胞术分析。 评估FcγRIIIa刺激的NK细胞的趋化因子/细胞因子产生注意：可以使用不同的方法和/或试剂盒来评估趋化因子和细胞因子的产生。 达到刺激的时间点（步骤2.7）后，立即将管子放在冰上，并在4°C下以135×g的冷藏离心机旋转5分钟。 将上清液转移到干净的容器中。冷冻上清液，直到使用所需的测定评估趋化因子或细胞因子。注意：细胞沉淀现在可以用冰冷的PBS洗涤并进行处理以进行信号传导，基因表达和细胞骨架重排研究。