チオバルビツール酸反応性物質アッセイを用いた生体試料における酸化ストレスの評価

脂質過酸化は、活性酸素種や反応性窒素種などのフリーラジカルが、脂質中の炭素炭素二重結合を攻撃するプロセスであり、炭素からの水素の抽象化と酸素分子の挿入を伴うプロセスである。このプロセスは、主要な製品として、脂質ペルオキシルラジカル、およびヒドロペルオキシドを含む複雑な製品の混合物、ならびに主要な二^{次製品として}マロンジアルデヒド(MDA)および4-ヒドロキシノンを含む。

MDAはチオバルビツール酸(TBA)との容易な反応による脂質過酸化のマーカーとして、生物医学研究で広く使用されています。この反応は、₅₃₂ nmの可視スペクトルで吸収し、赤-ピンク色²を生成するコンジュゲートであるMDA-TBA2の形成につながります。MDA以外の脂質過酸化に由来する他の分子も、TBAと反応して532nmで光を吸収し、測定される全体的な吸収シグナルに寄与する。同様に、MDAは生体分子の他のほとんどの主要クラスと反応することができ、^TBA3,4との反応に対するアクセシビリティを制限する可能性^{があります}。したがって、この伝統的なアッセイは、単に「チオバルビツール酸反応性物質」または^TBARS5を測定すると考えられています。

TBARSアッセイは、正しく適用され、解釈されると、一般的に生物学的サンプル⁶における酸化ストレスの全体的なレベルの良好な指標と考えられます。残念ながら、Khoubnasabjafariと他の人によって文書化されているように、TBARSアッセイはしばしば疑わしい結論^{3、4、7、8}、^9、10、11を容易にする方法で行われ^、解釈されます。この原因は、主にサンプル関連の前分析変数と、アッセイ結果の大幅な変更なしにアッセイプロトコルの一見軽微な変動を禁止するアッセイ堅牢性の欠如に根ざしています^1,7,12,13。

生体試料の取り扱いと保存に関連する前分析変数(例えば、血漿を-20°Cに一時的に保つ)^14,15は、TBARSアッセイ結果に大きな影響を与える可能性があります^16,17;TBARSアッセイの結果は、明示的なラボ間分析検証データによって保証されない限り、異なる実験室間で比較されるべきではありません。この推奨事項は、ウエスタン ブロットの一般的な使用方法と解釈方法に似た方法です。バンド密度の比較は、ブロット内およびおそらく実験室内の研究に有効であるが、実験室間のバンド密度を比較することは一般的に無効な慣行と考えられる。

一部の研究者は、TBARSアッセイによって測定されたMDAが、許容可能なバイオ^{マーカー3、9,10、18,19}に必要な分析基準または臨床基準を単に満たしていないことを示唆している。確かに、50年以上前にアッセイが開発されていなかったら、今日の広範な使用と暗黙の受け入れ能力を得ることはなかったでしょう。酸化ストレスの決定に使用される分析感度、特異性、および堅牢性を有するアッセイは他にもありますが、532nmでの吸光度に基づくTBARSアッセイは、脂質過酸化²⁰の決定に最も一般的に使用されるアッセイの1つであり、それによって酸化ストレスの評価を行います。

TBARSアッセイは、使用される試薬のほとんどの濃度に関する詳細な情報を提供しない高価なキット(400米ドル以上)としてのみ見つけることができます。また、提供される試薬は、1キットにつき1つの色分け標準曲線しか作ることができないため、1つの実験にのみ使用できます。これは、同じ標準曲線を複数回使用できないため、異なるタイムポイントで数サンプル内の酸化レベルを決定しようとする研究者にとって問題になる可能性があります。したがって、複数の実験のために複数のキットを購入する必要があります。現在、高価なキットを購入しない限り、TBARSアッセイの実行方法に関する詳細なプロトコルはありません。過去に一部の研究者は、TBARS ^assay21,22を実行する方法を漠然と説明してきましたが、高価なキットなしでTBARSアッセイを行う方法に関する完全に詳細なプロトコルや包括的なビデオは文献で入手できません。

ここでは、簡単で再現性の低い方法でTBARSアッセイを実行する方法に関する詳細で分析的に検証された目的別方法論を報告します。ヒト血清の脂質過酸化、HepG2溶糖、およびCu(II)イオンによる処理時の低密度リポタンパク質の変化が、TBARSアッセイの例示的な用途として実証されています。結果は、このTBARSアッセイが日常的に一貫して再現可能であることを示しています。