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발생학

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

Published: October 09, 2020
doi:
10.3791/61086
,
1Development, Disease Models & Therapeutics Graduate Program, Department of Molecular and Cellular Biology, Department of Neuroscience, Center for Cell and Gene Therapy, Stem Cells and Regenerative Medicine Center,Baylor College of Medicine

Summary

Descriviamo una tecnica per profilare i microRNA nei primi embrioni di topo. Questo protocollo supera la sfida dell’input a bassa cellula e del piccolo arricchimento dell’RNA. Questo saggio può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti nell’espressione del miRNA nel tempo in diversi lignaggi cellulari dell’embrione del topo precoce.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono importanti per la complessa regolazione delle decisioni sul destino cellulare e la tempistica dello sviluppo. Gli studi in vivo sul contributo dei miRNA durante lo sviluppo precoce sono tecnicamente impegnativi a causa del numero di cellule limitanti. Inoltre, molti approcci richiedono che un miRNA di interesse sia definito in saggi come il gonfiore settentrionale, il microarray e il qPCR. Pertanto, l’espressione di molti miRNA e dei loro isoformi non sono stati studiati durante lo sviluppo precoce. Qui, dimostriamo un protocollo per il sequenziamento di piccoli RNA delle cellule ordinate dagli embrioni primiti di topo per consentire una profilazione relativamente imparziale dei miRNA nelle prime popolazioni di cellule della cresta neurale. Superiamo le sfide della bassa selezione delle dimensioni e dell’input delle cellule durante la preparazione della biblioteca utilizzando l’amplificazione e la purificazione basata sul gel. Identifichiamo l’età embrionale come una variabile che rappresenta la variazione tra le repliche e gli embrioni di topo corrispondenti al palcoscenico deve essere utilizzata per profilare con precisione i miRNA nelle repliche biologiche. I nostri risultati suggeriscono che questo metodo può essere ampiamente applicato per profilare l’espressione di miRNA da altre linee di cellule. In sintesi, questo protocollo può essere utilizzato per studiare come i miRNA regolano i programmi di sviluppo in diversi lignaggi cellulari dell’embrione primo topo.

Introduction

Una questione centrale della biologia dello sviluppo è come una singola cellula indifferenziata possa dare origine a un intero organismo con numerosi tipi di cellule complesse. Durante l’embriogenesi, il potenziale di sviluppo delle cellule diventa progressivamente limitato man mano che l’organismo si sviluppa. Un esempio è il lignaggio della cresta neurale, che si differenzia progressivamente da una popolazione cellulare multipotente in vari derivati terminali, come neuroni periferici, glia, osso cranico e cartilagine. Le cellule della cresta neurale vengono specificate dall’ectoderma durante la gastrapolazione e quindi subiscono un epiteliale alla transizione mesenchymal e migrano attraverso l’embrione in posizioni discrete in tutto il corpo dove si differenzianoterminalmente 1. Decenni di lavoro hanno scoperto una rete di regolamentazione genetica trascrizionale, ma molto meno si sa sui meccanismi della regolazione post-trascrizione che controllano i tempi dello sviluppo della cresta neurale.

Il lavoro precedente suggerisce che i microRNA (miRNA) reprimono l’espressione genica per una corretta tempistica dello sviluppo e le decisioni sul destinocellulare 2,3,4,5,6. Gli studi sui miRNA nello sviluppo della cresta neurale si sono in gran parte concentrati sulle fasi successive dello sviluppo craniofacciale. Ad esempio, miR-17-92 e miR-140 sono fondamentali per la palatogenesi durante lo sviluppo craniofacciale nel topo e nel pesce zebra,rispettivamente 7,8. Il contributo dei miRNA alle prime decisioni sul destino della cresta neurale dell’embrione non è stato studiato a fondo. Gli studi sui miRNA nelle prime decisioni sul destino sono stati limitati da sfide tecniche come il basso numero di cellule presenti nei primi embrioni.

I MiRNA sono stati profilati in vitro da linee cellulari utilizzando corpi embrionali in diverse fasi di differenziazione per modellare lo sviluppo precoce del topo9. L’indagine sui piccoli RNA in vivo durante lo sviluppo iniziale dei mammiferi è stata relativamente limitata. I metodi precedenti per profilare i miRNA hanno portato alla distorsione come sequenza nota viene utilizzata per analizzare l’espressione di un miRNA specifico in metodi come qPCR, microarray e northern blots10. Il sequenziamento di nuova generazione e il miglioramento degli strumenti molecolari ora consentono un’analisi relativamente imparziale dell’espressione del miRNA per studiare il loro contributo allo sviluppo precoce dei mammiferi e alle decisioni sul destino cellulare.

Qui, segnaliamo una tecnica per raccogliere e sequenziare piccoli RNA espressi in cellule di cresta neurale da embrioni di topo primi che attraversano la gastrazione (E7.5) all’inizio dell’organogenesi (E9.5). Questa tecnica è semplice e combina il tracciamento della derivazione, l’ordinamento delle celle e la selezione delle dimensioni basate su gel per preparare piccole librerie di sequenziamento dell’RNA da un numero minimo di celle per il sequenziamento di prossima generazione. Sottolineiamo l’importanza per una rigorosa corrispondenza dello stadio somite degli embrioni per risolvere intervalli di tempo di 6 ore per ottenere una visione completa dei miRNA durante i rapidi cambiamenti dello sviluppo precoce. Questo metodo può essere ampiamente applicato agli studi genetici e di sviluppo ed evita la pooling degli embrioni. Descriviamo un modo per superare le sfide dei metodi attuali come l’arricchimento del miRNA utilizzando la purificazione basata sul gel, la quantificazione della libreria e la riduzione al minimo dei pregiudizi introdotti dalla PCR. Questo metodo è stato utilizzato per identificare i modelli di espressione miRNA nel tempo per studiare come i miRNA controllano la tempistica dello sviluppo nel lignaggio della cresta neurale degli embrioni di topo.

Protocol

Tutte le procedure di ricerca e cura degli animali sono state approvate dal Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee e ospitate nell’Associazione per la valutazione e l’accreditamento di strutture animali approvate dal Laboratorio Animal Care presso il Baylor College of Medicine. Tutti i ceppi sono stati mantenuti sullo sfondo C57BL6. 1. Dissezione dell’embrione (E7.5-E9.5) Rimuovere le corna uterino da un topo femmina incinta, sterilizzando l’addome con il 70% di etanolo dove deve essere fatta l’incisione. Pulire l’utero risciacquando con fosfato tamponato salina (PBS). Mettere l’utero in un piatto sterile di plastica da 10 cm. Utilizzando le forbici di microsezione, separare ogni regione contenente decidua l’una dall’altra. Sbucciare il muscolo uterino ed esporre tutti i deciduae. Uno per uno, rimuovere il decidua da ogni embrione. Togliere il sacco del tuorlo da ogni embrione e risparmiare per la genotipazione. Spostare tutti gli embrioni in un nuovo piatto di PBS fresco per l’imaging. Scatta un’immagine dell’intera lettiera. Immagine di ogni embrione individualmente e contare il numero di somiti di ogni embrione. Mantenere l’ingrandimento e l’esposizione (per la fluorescenza) lo stesso tra gli esperimenti.NOTA: Riteniamo che l’esposizione di 50-200 ms sia adeguata alla fluorescenza e che 20 ms siano adeguati per l’impostazione di campi luminosi. 2. Dissociazione dell’embrione e smistamento delle cellule Per ogni embrione da ordinare, eseguire le operazioni seguenti. Decapitare appena sopra il placode otico per gli embrioni più vecchi di E8.0 (se si desidera solo le cellule etichettate della regione craniale). Per gli embrioni E7.5, rimuovere le strutture extraembryonica (se si desidera solo l’embrione). Spostare la testa in un volume minimo di PBS su un pozzo pulito di una piastra 48-well. Aggiungere 250 L di papaina (27 U/mL). Pipette su e giù delicatamente utilizzando un p200. Controllare al microscopio e cercare grumi e singole cellule. Ripetere il pipettamento delicato su e giù fino a quando non viene raggiunta una sospensione a cella singola (di solito tre giri di pipettamento su e giù che dovrebbero equivalere a tra 30 s a 1 min per E7.5-E9.5). Quench con 250 L di siero bovino fetale (FBS). Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.5 per ogni embrione da ordinare. Filtrare 500 L di sospensione cellulare attraverso un tubo di tappo del filtro a rete in nylon da 35 m per rimuovere i grumi. Prendere il filtrato e passare al nuovo tubo da 1,5 mL e girare a 200 x g per 5 min. Rimuovere supernatant con attenzione e trasferire al nuovo tubo (salvare fino a quando le cellule vive sono noti per essere nel pellet). Rispendere il pellet cellulare in 300 L di PBS contenente 0,5-1% di albumina di siero bovino e continuare a essere sul ghiaccio fino allo smistamento (ridurre al minimo il tempo da qui alla fine dello smistamento). Se lo si desidera, prendere 10 L di sospensione cellulare e combinare con 10 L di blu Trypan (0,4%) e contare utilizzando un emocitometro per identificare la quantificazione approssimativa delle cellule e la vitalità come blu Trypan macchia solo le cellule morte. Appena prima dell’ordinamento, filtrare di nuovo ogni campione attraverso un tubo di tappo del filtro e aggiungere una macchia DAPI per le celle vive. Ordinare ogni campione in 500 L della soluzione di lysis di estrazione dell’RNA (vedere Tabella dei materiali) sulla sorter delle cellule con ugello da 70 m. Mescolare e conservare a -80 gradi centigradi fino alla raccolta di tutti i campioni. Procedere da questo punto solo quando vengono raccolti tutti i campioni necessari per un esperimento per ridurre la variazione tecnica tra i cicli di preparazione della libreria. 3. Estrazione dell’RNA NOTA: Il protocollo è adattato dal kit di isolamento RNA; vedere Tabella dei materiali. Aggiungere 500 L della soluzione di lysi per l’estrazione dell’RNA (vedere Tabella deimateriali ) ad ogni campione per rendere il volume totale di 1000 L. Scongelare ogni campione a temperatura ambiente. Vortex ogni campione per 1,5 min, assicurandosi che il tappo sia sicuro su ogni tubo prima di iniziare l’omogeneizzazione. Incubare l’omogeneato a temperatura ambiente (15-25 gradi centigradi) per 5 min. Aggiungere 140 L di cloroformio, tappo tubo in modo sicuro e agitare vigorosamente per 15 s. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Centrifuga per 15 minuti a 12.000 x g a 4 gradi centigradi. Trasferire la fase aques superiore in un nuovo tubo di raccolta sul ghiaccio. Non trasferire alcuna fase interffensiva o organica. Quando ci si avvicina alla fase organica rosa, puntare il tubo a lato e rimuovere le piccole aliquots fino a quando non è possibile raccogliere alcuna fase chiara aques. Misurare il volume di RNA contenente una fase aques raccolta da ogni campione per il calcolo corretto nella fase successiva. Aggiungere 1,5 volumi (di solito 525 L ma può essere leggermente più o meno) di etanolo al 100% e mescolare accuratamente mediante pipettatura. Pipetta fino a 700 campioni di L, incluso qualsiasi precipitato, in colonna in un tubo di raccolta di 2 mL. Chiudere il coperchio e la centrifuga ≥ 8.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Eliminare il flusso.Discard the flow-through. Ripetere il passaggio 3.8 utilizzando il resto del campione. Lavare la colonna secondo le istruzioni del produttore. Asciugare la colonna ruotando a tutta velocità per 1 min. Trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 mL. Pipette 11 L di acqua libera nuclea sul centro della membrana. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 min. Spin velocità massima per 1 min per elute fuori dalla colonna. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e uno strumento parallelo di elettroforesi capillari (Tabella dei materiali). 4. Preparazione della biblioteca NOTA: Il protocollo è adattato dal manuale del kit di preparazione della biblioteca dell’RNA; vedere Tabella dei materiali. Completare la denaturazione e la legatura dell’adattatore da 3′ come indicato nel manuale del kit di preparazione della libreria di RNA utilizzando la diluizione da 1/4 dell’adattatore da 3′. Continuare a esorsire 3′ dell’adattatore. Completare l’esaurimento dell’adattatore come indicato nel manuale del piccolo kit di preparazione della libreria dell’RNA. Assicurarsi di utilizzare l’80% di etanolo appena preparato per la pulizia della perline e che tutto l’etanolo in eccesso venga completamente rimosso appena prima della resuspensione nell’acqua senza nuclease senza asciugare eccessivamente le perline (la rottura del pellet di perline viene osservata al momento dell’eccesso di essiccazione). Procedere direttamente all’inattivazione dell’adattatore in eccesso. Completare l’inattivazione dell’adattatore in eccesso come indicato nel manuale del kit di preparazione della piccola libreria di RNA che assembla tutti i reagenti sul ghiaccio. Continuare con la legatura dell’adattatore 5′ 4N. Completa la legatura dell’adattatore da 5′ come indicato nel manuale del piccolo kit di preparazione della libreria dell’RNA, assicurandosi di utilizzare una diluizione da 1/4 dell’adattatore da 5′ e di assemblare tutti i reagenti sul ghiaccio. Procedere con la trascrizione inversa. Completa la sintesi del filamento di trascrizione inversa, come indicato nel manuale del kit di preparazione della piccola libreria di RNA e facendo attenzione ad assemblare tutti i reagenti sul ghiaccio e non tenere l’enzima fuori dal congelatore per lunghi periodi di tempo.NOTA: A questo punto, il protocollo può essere interrotto, con campioni conservati durante la notte a 4 gradi centigradi. In alternativa continuare con l’amplificazione PCR. Completare l’amplificazione PCR assemblando i reagenti come indicato nel manuale del kit di preparazione della piccola libreria di RNA e riducendo al minimo il numero di cicli PCR. Il numero di cicli PCR deve essere determinato sperimentalmente per ogni applicazione e deve essere utilizzato il numero minimo di cicli. Qui abbiamo usato 16 cicli per amplificare con successo le nostre piccole librerie di RNA. Procedere direttamente alla selezione delle dimensioni. 5. Selezione delle dimensioni Per ogni campione, aggiungere 5 L di 6x gel di carico colorante e pipetta per mescolare. Caricare 10 L di scala al primo pozzo del gel, lasciando il pozzo immediatamente a destra vuoto. Caricare tutto il prodotto dal punto 5.1 su un acido Tris/borate/etilenediaminetetraacetic del 6% – gel poliacrilammide (TBE-PAGE) e lasciare 1 corsia tra ogni campione.NOTA: mantenere il contenitore in cui è arrivato il gel per i passaggi successivi. Eseguire il gel a 150 V per circa 30-40 min in buffer di corsa TBE 0,5x (fino a quando la fascia di tintura inferiore è vicino alla parte inferiore del gel, 0,5-1 cm). Fare 1 L di soluzione di colorazione mentre il gel è in esecuzione: SYBR Gold diluito 1:10,000 in 0.5x TBE. Quando il gel ha terminato la corsa (cioè, la fascia di tintura inferiore è vicino al fondo del gel), rimuovere con attenzione il gel dalle lastre di vetro, notando l’orientamento del gel. Mettere il gel nel vassoio della sua confezione originale. Rimuovere il TBE 0,5x e sostituirlo con la soluzione di colorazione dal punto 5.5. Gel di stagna per 15 min. Potrebbe essere necessario aumentare il tempo di colorazione. Posizionare il gel su un transilluminatore UV, facendo attenzione a non strappare il gel e mantenendo l’orientamento di cui sopra (ri-macchia per più tempo se le bande di scala non possono essere chiaramente visibili). Immagine del gel una volta che la colorazione è completa su transilluminatore UV con una fotocamera. Se è necessaria un’immagine migliore, utilizzare prima un apparato di imaging diverso dal transilluminatore UV per acquisire un’immagine del gel prima di tagliare le bande su un transilluminatore UV come imaging direttamente sul transilluminatore UV provoca la colorazione variabile dello sfondo, come mostrato nella Figura 3A-B. Non spostare il gel troppe volte in quanto è delicato e può strappare. Identificare e rimuovere la banda da 150 bp utilizzando una lama di rasoio pulita e posizionarlo in un tubo pulito da 1,5 mL. Non tagliare la banda da 130 bp (prodotto dimer dell’adattatore). Immagine del gel dopo aver rimosso le sezioni contenenti il prodotto della libreria a scopo di documentazione. Ruotare i tubi microcentrifuge contenenti la fetta di gel alla velocità massima per 30 s per raccogliere le fette nella parte inferiore di ogni tubo. Utilizzare una punta p200 per ogni campione per schiacciare la fetta di gel nei bit più piccoli possibili. Espellere ogni punta in ogni tubo. Per ogni tubo, aggiungere 300 L di buffer di eluizione, facendo attenzione a lavare i bit di gel dal lato del tubo e riattaccare la punta p200 e lavare la punta per ogni campione. Collocare i campioni di eluizione in un’incubatrice di agitazione impostata su 25 gradi centigradi. Incubare durante la notte con 1000 rpm tremante. Rimuovere i tubi dall’incubatrice e girare alla velocità massima per 10 min a temperatura ambiente. Trasferire il supernatant contenente il prodotto della libreria su una piastra di 96 po ‘ 96 gratuita RNase da 2 mL. Fare attenzione a non trasferire alcun gel. Aggiungere 50 perline di pulizia 50 L a ogni campione e mescolare mediante pipettatura. Immediatamente, aggiungere 350 lL di isopropanolo e mescolare mediante pipettatura. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti con dondolo. Piastra di rotazione a impulsi per le perline di pellet e poi magnetizzare per 2 min. Rimuovere e scartare con cura il supernante. Aggiungere 950 L di etanolo all’80%. Incubare per 30 s. Rimuovere tutti i supernante. Ripetere per un totale di due lavaggi di etanolo. Asciugare il campione per 3 minuti. In questa fase fare attenzione a rimuovere qualsiasi etanolo residuo che si raccoglie nella parte inferiore di ogni pozzo (non più di una volta) e di non asciugare troppo le perline (l’essiccazione troppo si tradurrà in screpolature del pellet di perline). Rimuovere tutto il liquido residuo nella parte inferiore del pozzo. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Riespendere il pellet in 13 L di buffer di resuspensione. Mescolare per pipetta fino a ottenere un valore omogeneo. Incubare per 2 min e poi magnetizzare per 3 min. Trasferire 12 L di supernante in un tubo pulito o in un pozzo di piastra pulita per la successiva conservazione. Conservare tutti i campioni a 4 gradi centigradi durante la notte o a -20 gradi centigradi a lungo termine. Controllare le dimensioni e la concentrazione dei frammenti presenti in ogni libreria utilizzando il test del DNA ad alta sensibilità dell’elettroforesi capillare. Confermare la concentrazione con più di un metodo.NOTA: Occasionalmente abbiamo usato il kit di sensibilità standard per evitare di sovraccaricare l’elettroforesi capillare.

Representative Results

Utilizzando la procedura illustrata qui, abbiamo raccolto embrioni a E7.5, E8.5 ed E9.5. Le strutture extraembryonica sono state rimosse da tutti gli embrioni e poi gli embrioni sono stati messi in scena per risolvere intervalli di tempo di 6 ore (Figura 1A-1B). Utilizzando l’analisi dei componenti di principio per raggruppare i campioni in base alla somiglianza, troviamo che i campioni si raggruppano per età, evidenziando la variazione come risultato dell’età embrionale e la necessità di un’attenta corrispondenza del somite per le repliche biologiche (Figura 1C). Abbiamo profilato l’epiblast pluripotente all’E7.5, il lignaggio ha tracciato le cellule della cresta neurale premigritoria e migratoria utilizzando Wnt1-Cre a E8.5 e le cellule della cresta neurale migratoria utilizzando Sox10-Cre a E9.5(Figura 1D). Qui raccogliamo specificamente la cresta neurale craniale decapitando l’embrione appena sopra il placode otico. Un confronto tra i due Cre-driver (Wnt1 e Sox10) che vengono spesso utilizzati per etichettare le cellule della cresta neurale conferma che contrassegnano popolazioni diverse negli embrioni primi del topo (Figura 1E). Sono state utilizzate strategie di Gating per ottenere singole cellule positive RFP vive che sono state ordinate direttamente nella soluzione di LYsis di estrazione RNA (vedere Tabella dei materiali) e memorizzate a -80 gradi centigradi ( Figura1F). È importante tenere traccia di quante cellule sono state raccolte da ogni campione. L’isolamento dell’RNA è stato eseguito utilizzando una versione modificata del protocollo del kit RNA. In particolare, usiamo le colonne mini RNA che devono essere conservate a 4 gradi centigradi. Queste colonne sono utili per l’eluizione in un piccolo volume (11 L) per ottenere la più alta concentrazione possibile di RNA da campioni in cui l’input cellulare è limitante. Per questo stesso motivo, è importante ottenere tutta la fase aque dopo l’estrazione del cloroformio fenolo. Il tubo lento e l’inclinazione del tubo da un lato durante la raccolta sono fondamentali per massimizzare la resa. In questa procedura, quantifichiamo l’RNA utilizzando sia uno spettrofotometro, per ottenere informazioni sulla contaminazione sale/proteina, sia un elettroforesi capillare per misurare la concentrazione (Figura 2). La traccia dello spettrofotometro rivela che l’RNA è stato isolato senza proteine contaminanti ma ha un alto contenuto di sale(Figura 2A-2B). Idealmente il rapporto 260/280 dovrebbe essere di 1,8 dollari e il rapporto 260/230 dovrebbe essere >2.0. La resa totale di RNA misurata dallo spettrofotometro non è aumentato con l’età compresa tra E8,5-E9,5. Ciò è dovuto alla risoluzione dello spettrofotometro che non è abbastanza sensibile da rilevare i cambiamenti nella concentrazione di RNA dal numero di cellule che stiamo raccogliendo, e si consiglia di utilizzare le informazioni di concentrazione ottenute dall’elettroforesi capillare (Figura 2C). La traccia dell’elettroforesi capillare può essere utilizzata per stimare la concentrazione e le dimensioni dei frammenti di RNA. I picchi <1000 nucleotidi sono indicativi di degradazione. La traccia rappresentativa è coerente con l'RNA che non è degradato. I picchi a 2000 nucleotidi e 5100 nucleotidi sono rispettivamente 18 e 28 rRNA. La piccola regione dell'RNA si trova a 150 nucleotidi(Figura 2D). Piccole librerie di sequenziamento dell’RNA sono state preparate utilizzando il piccolo kit di preparazione della libreria dell’RNA descritto nella Tabella dei Materiali. Qui usiamo poco meno della metà dell’RNA ottenuto da ogni campione (4 L dell’eluzione 11 L, 80-120 ng) che consente di sintetizzare le librerie di sequenziamento dell’RNA dall’RNA rimanente di ogni campione. Qui diluiamo i piccoli adattatori RNA da 3′ e 5′ per ridurre la quantità di dimeri dell’adattatore presenti e suggeriamo che le fasi di legatura, pulizia e trascrizione inversa dell’adattatore siano completate il più possibile in modo continuo. Abbiamo usato 16 cicli PCR per amplificare le librerie e suggerire che il numero minimo di cicli PCR per qualsiasi esperimento sia determinato empiricamente. Completando i cicli PCR in eccesso, si potrebbe gonfiare artificialmente il conteggio delle leggi di un miRNA espresso in modo basso. La selezione delle dimensioni è indispensabile per arricchire le librerie di miRNA e non i dimer dell’adattatore, che sono in genere presenti. Le dimensioni del prodotto della libreria (150 bp) e i dimer dell’adattatore (130 bp) hanno dimensioni molto simili. L’estrazione del gel viene utilizzata per isolare le piccole librerie di sequenziamento dell’RNA lontano dai dimer dell’adattatore (Figura 3). Un’immagine di un gel PAGE prima dell’escissione mostra che in ogni campione sono presenti una moltitudine di dimensioni del prodotto (Figura 3A). È importante lasciare una corsia aperta tra due campioni qualsiasi o una scala che viene caricata sul gel. Il fronte di migrazione nella parte inferiore del gel è leggermente curvo, indicando che potrebbe essere necessario correre a una velocità inferiore se la banda da 150 bp è difficile da distinguere per tutti i campioni. Questa immagine rappresentativa mostra anche un’abbondanza di prodotto 150 bp dalla maggiore concentrazione di RNA di controllo positivo (RNA totale dal cervello di un ratto) che è andato nella preparazione della libreria rispetto a quello che è andato in ogni campione embrionale. Il controllo negativo rivela che i reagenti erano liberi di contaminare le specie di acido nucleico (Figura 3A). L’escissione della banda da 150 bp deve essere eseguita con una lama di rasoio pulita e l’area raccolta è illustrata nella figura 3B. Le tracce di elettroforesi capillari prima e dopo la selezione delle dimensioni mostrano il notevole miglioramento della purezza del prodotto della libreria da 150 BP con purificazione del gel (Figura 3C-3D). È importante notare che le tracce in Figura 3C-3D hanno picchi di esempio superiori ai marcatori, indicativi di overload. In questi casi, la dimensione dei frammenti può essere accurata, tuttavia la concentrazione non può. La quantificazione può essere ottenuta diluindo le librerie nella gamma dei marcatori o utilizzando metodi alternativi. Troviamo alcune variazioni tra i metodi alternativi di quantificazione della libreria e raccomandiamo di testare empiricamente più metodi di quantificazione. La quantificazione accurata della concentrazione è essenziale quando si massimizza il numero di campioni da sequenziare in una sola volta. Le librerie saranno diluite fino a 1,3 pM per il sequenziamento e generalmente da 15-25 campioni possono essere sequenziati contemporaneamente su un kit di sequenziamento del ciclo 150 che fornisce letture di 140 milioni di dollari. Questo si traduce in circa 5 milioni di letture per campione. Generalmente i tassi di mappatura sono tra il 60-80%. Figura 1: Raccolta di cellule da embrioni di topo per il sequenziamento dell’RNA di piccole dimensioni. (A) Embrione di topo E8.5 per evidenziare la rimozione del sacco del tuorlo e somiti utilizzati per determinare lo stadioCdell’embrione( B ) Somite staging degli embrioni di topo per catturare le fasi dello sviluppo della cresta neurale ( C ) Analisi dei componenti di principio delle librerie presposte da cellule di cresta neurale di tipo selvatico ordinate che mostrano che i campioni gruppo per età (D) Schematico che mostra come i campioni sono stati raccolti utilizzando Wnt1-Cre a E8.5 per etichettare le cellule della cresta neurale premigritoria e migratoria e i Sox10-Cre a E9.5 per etichettare solo le cellule della cresta neurale migratoria (E) Analisi dei componenti di principio delle librerie presfò da cellule di cresta neurale wildtype ordinate che mostravano campioni raggruppati per cresta indipendentemente dall’età (F) Strategia di Gating utilizzata per isolare le cellule della cresta neurale RFP dagli embrioni E8.5 e E9.5 utilizzando l’ordinamento FACS. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: isolamento dell’RNA dagli embrioni di topo E7.5-E9.5. (A) Traccia spettrofotometrica rappresentativa di un isolamento dell’RNA dallo stadio più giovane dell’embrione che abbiamo applicato questo protocollo. (B) Tabella che mostra i valori rappresentativi della qualità dell’RNA ottenuti dallo spettrofotometro. (C) Esempio di RNA raccolto da cellule di cresta neurale ordinate da embrioni di ogni età (D) Traccia di elettroforesi capillari che mostra RNA di buona qualità. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: librerie di miRNA prima e dopo la selezione delle dimensioni. (A) Gel TBE-PAGE che mostra piccole librerie rappresentative di RNA per quattro campioni e controlli prima e (B) dopo l’escissione della banda di 150 bp. Le frecce rappresentano la banda da avallare (C) Traccia elettroforesi capillary della piccola libreria di RNA prima e ( D )dopola selezione delle dimensioni. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I processi di sviluppo possono procedere rapidamente, e le cellule stanno subendo molte specifiche sequenziali tali da catturare una visione completa dei miRNA che contribuiscono alle prime decisioni sul destino, è necessaria una messa in scena più specifica rispetto all’incremento di mezza giornata ampiamente utilizzato. Un recente studio ha eseguito il sequenziamento dell’RNA dagli embrioni dello stadio 12 di Theiler che vanno da 3 a 6 somiti11. Troviamo che durante questo periodo di tempo, le cellule della cresta neurale sono specificate (3 somiti di età), delaminare (4 somiti di età) e migrare (5-6 somiti di età). Troviamo anche che, oltre al Cre-driver usato per lignaggio delle popolazioni di cellule traccia, l’età è la più grande fonte di variazione tra campioni biologici, e solo gli embrioni corrispondenti somite dovrebbero essere considerati come repliche. Questo dovrebbe essere preso in considerazione anche quando si confrontano gli embrioni transgenici con i controlli dei tipi selvatici.

I metodi precedenti per profilare i RNA durante lo sviluppo iniziale hanno utilizzato tra 10-100 ng di input di RNA per la preparazione della piccola libreria di sequenziamento dell’RNA e hanno messo in comune più embrioni inun campione 13,14. Dimostriamo l’isolamento dell’RNA e la preparazione della libreria da un singolo embrione E7.5 o da cellule di cresta neurale ordinate a E8.5 ed E9.5 utilizzando circa 100 ng di RNA totale come input. Quando si dissociano gli embrioni per lo smistamento, si dovrebbe fare attenzione a guardare la dissociazione al microscopio e placare la reazione di osservare quando si ottengono singole cellule. Troviamo che la dissociazione della regione craniale degli embrioni E8.5-E9.5 è quasi istantanea con un leggero pipettamento manuale come descritto nel protocollo. Per i tessuti più grandi e gli embrioni sempre più vecchi, il tempo di dissociazione può essere più lungo a seconda della porzione dell’embrione di dissociata. Per gli embrioni E7.5-E9.5, i grumi di cellule sono facilmente visibili al microscopio e la dissociazione dovrebbe continuare fino a quando non sono visibili altri grumi. Le singole celle sono visibili in soluzione se si regola la messa a fuoco attraverso la soluzione nel pozzo ovunque da 5-10x. I metodi precedenti ordinano le cellule direttamente nel buffer di lysi per il sequenziamento dell’RNA per preparare l’RNA di massa da un basso numero dicelle 14. Qui si ordina direttamente nella soluzione di lysis di estrazione RNA in modo che l’RNA possa essere isolato prima dell’inizio della preparazione della libreria. L’uso di mini colonne con volume di eluzione di 11 L ha permesso una concentrazione di RNA abbastanza elevata in modo che una singola preparazione dell’RNA potesse essere suddivisa tra il sequenziamento di RNA piccolo e l’RNA alla rinfusa.

Una limitazione attuale della maggior parte dei piccoli metodi di sequenziamento dell’RNA è l’amplificazione PCR della cDNA convertita. Il nostro metodo non supera questa limitazione, ma siamo stati in grado di ridurre al minimo il numero di cicli PCR dal 25-massimo consigliato fino a 16 cicli. Questa riduzione dell’amplificazione diminuisce la distorsione dell’amplificazione artificiale introdotta dalla PCR. Un’altra fonte di distorsione è la legatura degli adattatori, dove è noto che sequenze specifiche situate alle estremità degli adattatori e dei miRNA possono legare insieme con maggiore efficienza rispetto ad altre sequenze. Per evitare questo problema, gli adattatori utilizzati in questo protocollo hanno 4 basi casuali incorporate alla fine di ogni adattatore per evitare la distorsione nelle reazioni di legatura. Inoltre, un altro problema comune è la quantità di dimeri dell’adattatore che si formano quando l’input dell’RNA è basso. Il kit di preparazione della libreria include passaggi per ridurre la formazione di dimer dell’adattatore, ad esempio l’inattivazione dell’adattatore e la pulizia del tallone, per rimuovere gli adattatori in eccesso dopo ogni legatura. Abbiamo anche diluito gli adattatori 3′ e 5′ 4N di 1/4 per ridurre la quantità di dimer dell’adattatore che può formarsi. Abbiamo scoperto che quando non viene diluita, l’intensità della banda di 130 bp aumenta rendendo difficile distinguere dalla banda da 150 bp contenente le piccole librerie di RNA desiderate su un gel.

Un’altra sfida attuale della preparazione delle librerie di sequenziamento è l’accurata quantificazione del prodotto prima del sequenziamento. Abbiamo scoperto che diversi metodi danno risultati diversi sulla stessa libreria. Suggeriamo che i ricercatori utilizzino più metodi di quantificazione per ottenere una stima accurata della concentrazione.

Questo protocollo può essere ampiamente applicato a studi genetici, di sviluppo o di altre applicazioni in cui l’RNA viene raccolto da un basso numero di cellule. Questo approccio semplifica gli studi temporali evitando la pooling degli embrioni e può essere facilmente applicato sia alle cellule non ordinate che a celle ordinate.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato sostenuto dalla Fondazione Andrew McDonough Bà e dal NIH (R01-HD099252, R01-HD098131.   R.J.P. è uno studioso CPRIT in ricerca sul cancro (RR150106) e V Scholar in Ricerca sul Cancro (V Foundation). Gli autori vorrebbero anche riconoscere il Nucleo di Citometria e Ordinamento Cellulare al BCM per fornire le attrezzature necessarie per questo progetto.

Materials

#5 Forceps Fine Science Tools Fisher Scientific NC9277114
0.4% Trypan blue ThermoFisher 15250061
10 cm Petri dishes Fisher Scientific 07-202-011
2-Propanol Miilapore Sigma I9516-500ML
5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL Bio-Rad 3450047
5200 Fragment Analyzer Agilent M5310AA
96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear Bio-Rad HSS9601
BD FACSAria II bdbiosciences
Bovine Serum Albumin, fraction V Fisher Scientific BP1600100
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Gendepot CA008-300
Eppendorf tubes Fisher Scientific 05-408-129
Ethanol Pure, 200 proof anhydrous Sigma Aldrich E7023-500ml
FC-404-2001 Illumina FC-404-2001
HS NGS Fragment kit Agilent DNF-474-0500
HS RNA Kit Agilent DNF-472-0500
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) Fisher Scientific NC1289113
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) Illumina FC-404-2001
NGS Fragment kit Agilent DNF-473-1000
Papain Worthington LK003176 resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL
SYBR Gold nucleic acid gel stain ThermoFisher S11494
Trizol LS ThermoFisher 10296028
UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV Fisher Scientific UVP95044701
Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 Fisher Scientific NC9609583
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References

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Keuls, R. A., Parchem, R. Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (164), e61086, doi:10.3791/61086 (2020).
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