Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente
Summary
La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.
Abstract
In utero l’elettroporazione è una tecnica di trasferimento del DNA in vivo ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base della corticogenesi dei mammiferi. Questa procedura sfrutta i ventricoli cerebrali per consentire l’introduzione del DNA di interesse e utilizza una coppia di elettrodi per dirigere l’ingresso del materiale genetico nelle cellule che rivestono il ventricolo, le cellule staminali neurali. Questo metodo consente ai ricercatori di etichettare le cellule desiderate e/o di manipolare l’espressione dei geni di interesse in tali cellule. Ha più applicazioni, tra cui saggi mirati migrazione neuronale, tracciamento del lignaggio, e pathfinding assonale. Una caratteristica importante di questo metodo è il suo controllo temporale e regionale, che consente l’elusione di potenziali problemi legati alla letalità embrionale o alla mancanza di topi driver CRE specifici. Un altro aspetto rilevante di questa tecnica è che aiuta a ridurre considerevolmente i limiti economici e temporali che coinvolgono la generazione di nuove linee del mouse, che diventano particolarmente importanti nello studio delle interazioni tra i tipi di cellule che hanno origine in aree lontane del cervello in diverse età dello sviluppo. Qui descriviamo una doppia strategia di elettroporrazione che consente il targeting di popolazioni cellulari separate spazialmente e temporalmente. Con questo approccio possiamo etichettare diversi sottotipi di cellule in luoghi diversi con proteine fluorescenti selezionate per visualizzarle e/o possiamo manipolare i geni di interesse espressi da queste cellule diverse nei momenti appropriati. Questa strategia aumenta il potenziale dell’elettroporazione in utero e fornisce un potente strumento per studiare il comportamento delle popolazioni cellulari separate temporalmente e spazialmente che migrano per stabilire contatti stretti, così come le interazioni a lungo raggio attraverso proiezioni assonali, riducendo i costi temporali ed economici.
Introduction
La corteccia cerebrale è una struttura molto complessa e finemente organizzata. Per raggiungere un tale grado di organizzazione, i neuroni di proiezione corticale passano attraverso processi di sviluppo complessi che richiedono la loro generazione temporale, la migrazione alla loro destinazione finale nella piastra corticale e la creazione di connessioni a breve e lungo raggio1,2. Per molto tempo, il modo classico per studiare la corticogenesi si basava sull’uso di modelli murini knockout o knock-in di geni di interesse. Tuttavia, questa strategia, e in particolare l’uso di topi knockout condizionali, richiede tempo e denaro, e talvolta presenta ulteriori problemi per quanto riguarda l’esistenza di ridondanza genetica o la mancanza di driver CRE specifici, tra le altre questioni. Uno degli approcci che è sorto per cercare di affrontare questi problemi e che è oggi ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo corticale è in elettroporazione utero3,4. In utero l’elettroporazione è una tecnica utilizzata per la transgenesi somatica, che consente il targeting in vivo delle cellule staminali neurali e della loro progenie. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare le cellule con l’espressione di proteine fluorescenti5,6, per la manipolazione genica in vivo (cioè, guadagno o perdita di test funzione)7,8,9, per isolare cortice elettropotizzate in vitro e colture8,10. Inoltre, l’elettroporazione in utero consente il controllo temporale e regionale dell’area mirata. Questa tecnica ha numerose applicazioni ed è stata ampiamente utilizzata per studiare la migrazione neuronale, divisione delle cellule staminali, connettività neuronale, e altri soggetti8,9,11,12.
Il manoscritto attuale descrive l’uso di una variante di elettroporazione in utero, definita doppia elettroporazione in utero, per analizzare le interazioni delle cellule nella corteccia cerebrale con diverse origini temporali e spaziali. Questi studi sono estremamente complessi da completare quando si impiegano modelli murini perché richiedono l’uso combinato di diverse linee transgeniche. Alcune delle applicazioni del protocollo descritto in questo documento includono lo studio delle interazioni ravvicinate tra le cellule vicine, così come le interazioni tra cellule distanti attraverso proiezioni a lungo raggio. Il metodo richiede l’esecuzione di due interventi chirurgici di elettroporazione indipendenti, separati temporaneamente e spazialmente, sugli stessi embrioni per indirizzare diverse popolazioni cellulari di interesse. Il vantaggio di questo approccio è la possibilità di manipolare la funzione genica in uno o entrambi i tipi di neuroni utilizzando animali di tipo selvaggio. Inoltre, questi esperimenti funzionali possono essere combinati con l’espressione di proteine citoplasmiche o fluorescenti marcate a membrana per visualizzare la morfologia fine delle cellule mirate, compresi dendriti e assoni, e analizzare le possibili differenze nelle interazioni cellulari rispetto a un controllo (cioè cellule etichettate solo con la proteina fluorescente).
Il protocollo qui delineato è focalizzato sullo studio delle interazioni cellulari all’interno della neocorteccia, ma questa strategia potrebbe essere utilizzata anche per esaminare le interazioni con aree extracorticali che possono essere prese di mira utilizzando in uteropozione, come il subpio o il talamo13,14, o interazioni cellula-cellula in altre strutture, come il cervelletto15. Il targeting di aree diverse si basa sull’orientamento degli elettrodi e sul ventricolo in cui viene iniettato il DNA (laterale, terzo o quarto). Con la strategia qui descritta, possiamo etichettare un numero considerevole di cellule, che è utile per valutare i cambiamenti generali nella connettività / innervazione in esperimenti funzionali. Tuttavia, per studiare i cambiamenti fini nella connettività, si possono utilizzare versioni modificate dell’elettroporazione in utero per ottenere l’etichettatura più scarsa e identificare le singole cellule16. In sintesi, la doppia elettroporazione in utero è un metodo versatile che consente di indirizzare le popolazioni cellulari separate temporalmente e spazialmente e di studiarne le interazioni in dettaglio, sia in condizioni di controllo che combinate con esperimenti funzionali, riducendo considerevolmente i costi temporali ed economici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio delle interazioni cellula-cellula in vivo in regioni ad alta densità cellulare come la corteccia cerebrale è un compito complesso. Gli approcci tradizionali, compreso l’uso di anticorpi per etichettare i neuriti non sono adatti a causa della mancanza di marcatori specifici per diverse popolazioni di cellule. L’uso di modelli murini transgenici, in cui un particolare tipo di cellula esprime una proteina fluorescente, è utile per visualizzare i processi neuronali, ma questo dipende dalla disponibilità di tali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Cristina Andrés Carbonell e i membri della struttura Animal Care dell’Universidad de Valencia per assistenza tecnica. Vogliamo anche ringraziare Isabel Farias e Sacramento R. Ferràn per i reagenti e la condivisione delle loro attrezzature con noi. I.M.W è finanziato da un contratto Garant’a Juvenil della Conselleria de Educaciàn de Valencia (GJIDI/2018/A/221), D.dA.D è finanziato dal Ministro de Ciencia, Innovaciàn y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150). C.Gil-Sanz detiene un Ramàn y Cajal Grant (RYC-2015-19058) dal ministro spagnolo Ciencia, Innovaciàn y Universidades (MICINN). Quest’opera è stata finanziata RYC-2015-19058 e SAF2017-82880-R (MICINN).
Materials
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Baby-mixter hemostat (perfusion) | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| Borosilicate glass capillary | WPI | 1B100-6 | |
| Buprenorphine (BUPREX 0,3 mg/ml) | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-EGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mCherry plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP plasmid | Kindly provided by U.Müller Lab | ||
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | |
| Cotton Swabs | BFHCVDF | ||
| Cyanoacrylate glue | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| Dissecting scope | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont Forceps #5 Fine Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | BTX | 45-0052 | |
| Electric Razor | Oster | 76998 | |
| Endotoxin-free TE buffer | QIAGEN | 1018499 | |
| Ethanol wipes | BFHCVDF | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| Eye ointment | Alcon | 682542.6 | |
| Fast Green dye | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| Fluorescence LEDs | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure Plasmid Maxi Kit | Roche | 3143422001 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats (suture) | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| Heating Pad | UFESA | AL5514 | |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| Iodine wipes | Lorsoul | ||
| Isofluorane vaporizer | Flow-Meter | A15B5001 | |
| Isoflurane | Karizoo | 586259 | |
| Ketamine (Anastemine) | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech precision wipes | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB (Lennox) Agar GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB (Lennox) broth GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| Low-melting point agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| Medetomidine (Sedator) | Dechra | 573749.2 | |
| Microscope coverslips | Menel-Gläser | 15747592 | |
| Microscope Slides | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| Mounting medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Mutiwell plates (24) | SPL Life Sciences | 32024 | |
| Mutiwell plates (48) | SPL Life Sciences | 32048 | |
| NaCl (for saline solution) | Fisher Scientific | 10112640 | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Orbital incubator S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta Incubator | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| Paraformaldehyde | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic perfusion pump | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm Diameter | Btx | 45-0489 | |
| Reflex Skin Closure System – 7mm Clips, box of 100 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex Skin Closure System – Clip Applyer, 7mm | AgnThos | 204-1000 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| Sodium azide | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| Surgical absorbent pad (steryle) | HK Surgical | PD-M | |
| Suture (Surgicryl PGA 6-0) | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| Syringe 1ml (BD plastipak) | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| Vertical microscope | Nikon | Eclipse Ni | |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
References
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