Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in Chlamydia trachomatis

La clamidia transamata è la principale causa di malattie batteriche sessualmente trasmissibili e rappresenta un onere significativo per la salute umana. Oltre 100 milioni di persone sono infettate ogni anno da C. trachomatis¹. Circa il 70% delle infezioni nelle donne sono asintomatiche nonostante gli effetti dannosi sulla salute riproduttiva, come la malattia infiammatoria pelvica, la gravidanza ectopica e/o l’infertilità. Il sequela della malattia è direttamente correlato all’immunopatologia iniziata da C. infezione da tracommatide ². Un vaccino efficace deve ancora essere sviluppato; pertanto, comprendere la funzione dei fattori di virulenza batterica e di altri prodotti genici batterici è una questione di ricerca importante e urgente.

Come batteri intracellulari, l’invasione delle cellule ospiti, la replicazione intracellulare, il rilascio di progenie e l’evasione delle risposte immunologiche ospiti sono processi critici. C. tracommatide forma una membrana parassofosa legata vacuole, chiamato inclusione, per lo sviluppo intracellulare. L’istituzione dell’inclusione e di molti altri processi critici si ottiene mediante la secrezione di proteine efsiate tramite un sistema di secrezione di tipo III (T3SS)³. Chiarire le funzioni di questi efficaci secreti è stato limitato per molti anni a causa dell’intrattabilità genetica di C. tracomatis. A differenza di E. coli, molte tecniche di clonazione classiche non sono applicabili alla clamidia. Alcune limitazioni principali riguardano l’efficienza della trasformazione, la mancanza di controselezione dei reporter come sacB e la manutenzione del plasmide. Mentre i plasmidi E. coli possono generalmente essere mantenuti a tempo indeterminato con un’origine di replicazione e di adeguata pressione selettiva, C. trachomatis plasmis richiede altri otto frame di lettura aperti (pgp1-8) per la manutenzione che si trovano sul plasmide nativo di pL2 all’interno del sierovar^{L2 4}.

Negli ultimi anni sono stati generati diversi strumenti genetici che ospitano la biologia unica della clamidia, eppure ci sono ancora limitazioni^5,6,7. La mutagenesi chimica mediante trattamento con metanoesolino etilico (EMS) può introdurre mutazioni di fracivi o (meno frequentemente) può provocare transizioni nucleotidiche che introducono un codone di arresto prematuro per produrre una mutazione senza senso⁸. L’inserimento di trasposoni è efficiente per la disgregazione genica, ma la tecnologia attuale nella ricerca della clamidia è laboriosa e richiede molto^tempo. Sia il trattamento EMS che le tecniche di mutagenesi trasposoni generano mutazioni casuali e richiedono rigorosi metodi di screening per isolare i ceppi mutanti. Un metodo per interrompere i geni mediante l’inserimento di introni di gruppo II (ad esempio, TargeTron) consente la mutagenesi diretta; tuttavia, questo metodo è limitato dall’efficienza e il sito di inserimento non è sempre previsto correttamente¹⁰.

La mutagenesi di scambio allelico segnalata dalla fluorescenza (FRAEM) è una strategia utilizzata per la cancellazione genica mirata accoppiata con l’inserimento di una cassetta di selezione che fornisce resistenza agli antibiotici e un reporter a fluorescenza¹¹. Tuttavia, il FRAEM è complicato dal potenziale degli effetti polari indotti da cassette sui geni a valle, specialmente quando si prendono di mira i geni all’interno degli operoni polcistronici. La mutagenesi allelica allocante a cassette flosche (FLAEM) è un nuovo approccio genetico sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti dalla cassetta precedentemente osservati con la cassetta di selezione FRAEM¹². FLAEM utilizza l’editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione e ripristinare l’espressione dei geni a valle. La cassetta di selezione contenente resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP) è riprogettata con siti loxP di fianco. Questi siti loxP possono ricombinarsi in presenza di Cre ricombinase e provocare l’escissione della cassetta dal genoma¹³. Questa strategia ha dimostrato di alleviare gli effetti polari indotti in cassetta quando si mira tmeA per^{l’eliminazione 12,14}.

Entrambi i metodi FRAEM e FLAEM utilizzano lo stesso vettore di suicidio, pSUmC 4.0, che può essere mantenuto in modo condizionale attraverso l’espressione inducibile di pgp6. L’espressione di pgp6 è stata precedentemente dimostrata necessaria per la ritenzione plasmide ed è quindi sfruttata per controllare la manutenzione del plasmide^11,15. Quando C. trachomatis viene coltivato in media integrati con tetraciclina anidisca (aTc) per indurre l’espressione pgp6, il vettore viene mantenuto. In assenza di aTc, il vettore viene perso. La cancellazione mirata del gene si ottiene attraverso lo scambio allelico del gene per la cassetta di selezione. Le regioni da 3 kb direttamente a monte e a valle del gene bersaglio fungono da bracci di omologia per la ricombinazione. Questi bracci sono clonati nel vettore pSUmC 4.0 che fiancheggia la cassetta di selezione. Gli eventi di trasformazione e ricombinazione C. trachomatis di successo sono osservati attraverso la segnalazione della fluorescenza. L’espressione di mCherry sulla spina dorsale vettoriale e gfp all’interno della cassetta di selezione produce inclusioni fluorescenti rosse e verdi. Una volta che l’aTc viene rimosso dai mezzi di coltura, le inclusioni solo verdi indicano eventi di ricombinazione riusciti con la perdita del vettore suicida e l’integrazione della cassetta di selezione nel genoma batterico.

FLAEM rappresenta un’estensione del FRAEM attraverso la successiva trasformazione di un vettore che esprime Cre ricombinase, pSU-Cre, nel ceppo mutante appena creato. Cre ricombinase facilita la ricombinazione tra i siti loxP e l’escissione della cassetta di selezione. Gli eventi di ricombinazione sono indicati tramite segnalazione di fluorescenza. Il vettore pSU-Cre codifica mCherry; pertanto, la trasformazione riuscita è indicata dall’aggiunta di fluorescenza rossa alle inclusioni che esprimono gfp. La coltivazione in assenza di pressione selettiva per la cassetta comporta una ricombinazione mediata in Cre nei siti loxP, e la perdita della cassetta è indicata da inclusioni solo rosse. Come per pSUmC-4.0, l’espressione inducibile di pgp6 viene utilizzata per mantenere in modo condizionale pSU-Cre. Una volta rimossa la selezione aTc e antibiotica, il plasmide viene curato e il conseguente ceppo di delezione senza marcatore non è fluorescente. Questo metodo affronta la questione degli effetti polari indotti da cassette.